王子實,李苗苗,王永明
(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,上海 200438)
基因編輯技術(shù)(genome editing)是在基因組水平上對DNA進(jìn)行修飾的遺傳操作技術(shù).目前最常用的基因組編輯技術(shù)是CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技術(shù)[1].CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括2個元件,分別是具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白和向?qū)NA(guide RNA, gRNA).gRNA是將crRNA和tracrRNA融合得到的,其中crRNA負(fù)責(zé)識別靶序列,tracrRNA負(fù)責(zé)結(jié)合Cas9蛋白[2].當(dāng)gRNA和Cas9蛋白結(jié)合后,gRNA序列就會將Cas9蛋白引導(dǎo)至和其序列互補(bǔ)的基因組區(qū)域,使得Cas9蛋白和目標(biāo)基因組序列結(jié)合,并切斷基因組DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)[3].細(xì)胞內(nèi)修復(fù)DNA雙鏈斷裂的2種主要途徑分別是非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HDR)[4].前者經(jīng)常引起堿基的缺失或者插入(indel),后者會精確地改造基因組序列[5-6].使用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除主要是通過NHEJ途徑實現(xiàn)的,NHEJ引發(fā)的indel會造成目標(biāo)基因發(fā)生移碼突變,其概率為2/3.純合敲除細(xì)胞系的構(gòu)建要求目標(biāo)基因的所有拷貝都發(fā)生移碼突變.理論上對于雙倍體細(xì)胞基因組,2個等位基因都發(fā)生indel引發(fā)的移碼突變的概率是(2/3)2.而如果目標(biāo)基因在基因組中存在多個拷貝,則編輯后構(gòu)建純合敲除細(xì)胞系的概率就進(jìn)一步降低為(2/3)n(n是基因拷貝數(shù)).所以拷貝數(shù)越多,敲除難度越大.
傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)使用普通的質(zhì)粒表達(dá)Cas9和gRNA,是瞬時表達(dá)系統(tǒng).質(zhì)粒隨著細(xì)胞的傳代擴(kuò)增而被稀釋,使得Cas9和gRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平下降,進(jìn)而降低了基因編輯的效率.為了克服上述缺點,本實驗室使用附著體載體(episomal vector)表達(dá)Cas9和gRNA,稱為epiCRISPR系統(tǒng)[7].附著體載體可以在真核細(xì)胞中擴(kuò)增[8],能夠長期表達(dá)外源基因.epiCRISPR除了表達(dá)Cas9和gRNA,還表達(dá)嘌呤霉素抗性基因,在藥物的篩選下,能夠富集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞,提高獲得純合敲除細(xì)胞系的效率.同時附著體載體不整合到基因組中,編輯完成后,撤除篩選藥物,質(zhì)粒會很快丟失,細(xì)胞不再表達(dá)外源基因.利用epiCRISPR技術(shù),可以實現(xiàn)平均80%以上的indel效率.
利用CRISPR/Cas9編輯基因時,編輯不一定會造成基因功能喪失.盡管基因編輯可能會導(dǎo)致多種形式的DNA序列改變,包括堿基置換和indel.但堿基置換可能并不會造成氨基酸的改變;即使氨基酸發(fā)生了改變,如果不是重要功能域的氨基酸,也不會使基因功能喪失.indel一般在幾十個堿基以內(nèi),如果長度是3的倍數(shù),會造成氨基酸數(shù)量的改變,但不一定會造成移碼突變.敲除基因的有效方法是在基因編碼區(qū)前端進(jìn)行編輯,當(dāng)indel長度不是3的倍數(shù)時,會造成移碼突變,蛋白的翻譯提前終止,進(jìn)而導(dǎo)致功能喪失.如果在基因上設(shè)計2個gRNA,它們中間刪除的長度不是3的倍數(shù),會增加移碼突變的概率[9].設(shè)計2個gRNA還有另外一個優(yōu)點,不同gRNA的活性差異很大,2個gRNA中的一個活性高就可以敲除基因,如果2個活性都高,敲除效率會更高.
HDAC全稱是組蛋白去乙?;?histone deacetylase),其主要功能是對染色質(zhì)中的組蛋白去乙?;cDNA復(fù)制、修復(fù)以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)都有密切的關(guān)聯(lián)[10].HDAC在生物體內(nèi)和很多基因的表觀遺傳狀態(tài)有關(guān)[11],是阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病[12]以及黑色素瘤[13],乳腺癌[14]等多種癌癥的潛在治療位點[15].HDAC家族包含11個基因,分別在不同的代謝過程中負(fù)責(zé)組蛋白的去乙?;且粋€作用廣泛、功能多樣的基因家族.因此,構(gòu)建HDAC純合敲除細(xì)胞系對于研究HDAC基因家族的功能是十分必要的.在本研究中,我們通過敲除HDAC家族基因探討附著體載體表達(dá)雙gRNA系統(tǒng)的有效性.一方面可以快速構(gòu)建HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系,為將來研究HDAC家族基因功能鋪墊良好的基礎(chǔ).另一方面,本實驗還可以從技術(shù)層面對結(jié)合使用epiCRISPR技術(shù)和雙gRNA技術(shù)的基因敲除效果進(jìn)行驗證.
本文中使用的細(xì)胞系為神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-N-BE(2)和HeLa細(xì)胞.轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌E.coliDH5α來源于TIANGEN.所有實驗用到的限制性內(nèi)切酶均來源于NEB.PCR引物合成以及DNA測序由Genewiz蘇州分公司完成.Western blot使用抗體來自Abcam,Santa-Cruz以及CST.
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)
神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-N-BE(2),培養(yǎng)基使用MEM(Gibco)+10% F12(Gibco)+10% FBS(Gibco),培養(yǎng)條件37℃,5% CO2.HeLa細(xì)胞系,培養(yǎng)基使用DMEM(Gibco)+10% FBS(Gibco),培養(yǎng)條件37℃,5% CO2.2種細(xì)胞均使用Thermo Nunclon系列一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng).
1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)gRNA以及基因編輯檢測PCR引物的設(shè)計
質(zhì)粒構(gòu)建過程中使用的所有內(nèi)切酶以及連接酶均來源于NEB.使用http:∥crispr.mit.edu: 8079/?網(wǎng)址提供的gRNA設(shè)計工具,在目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域設(shè)計臨近的2段gRNA作為實驗使用的gRNA.并且在gRNA目標(biāo)區(qū)域附近設(shè)計PCR引物,用以在PCR后使用T7E1(NEB)酶切檢測編輯效率.表1(見第414頁)展示了實驗中使用的gRNA以及相應(yīng)的PCR連接引物以及檢測引物.引物名稱中數(shù)字代表gRNA間距.
1.2.3 轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞轉(zhuǎn)染
轉(zhuǎn)染試劑: 轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine?2000(Invitrogen).
轉(zhuǎn)染流程: 細(xì)胞鋪板,當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部60%~70%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染.對于常見的6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染而言: 樣品1,使用150mL Opti-MEM(Gibco)與5μL Lipo 2000(Invitrogen)充分混合.樣品2: 150mL Opti-MEM(Gibco)與2000ng待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒充分混合,樣品1,樣品2在各自室溫靜置5min后充分混合到一起,再次室溫靜置20min.之后將混合樣品均勻滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)部.輕微搖晃培養(yǎng)皿使轉(zhuǎn)染試劑與培養(yǎng)基混勻.轉(zhuǎn)染17~20h后,更換新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),并使用相應(yīng)的藥物對細(xì)胞進(jìn)行篩選.
1.2.4 單克隆細(xì)胞分選與培養(yǎng)
開始轉(zhuǎn)染為第0天.在使用藥物篩選10天后,使用細(xì)胞計數(shù)法對編輯后的細(xì)胞進(jìn)行稀釋分選,確保96孔板(Thermo)平均每孔中有一個細(xì)胞.在第15天觀察每孔中實際細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞存活情況,確認(rèn)真正的單克隆數(shù)量.第20天后將生長正常的單克隆進(jìn)行傳代,能夠存活到2次傳代以上的單克隆可以認(rèn)為是一個穩(wěn)定的單克隆.
表1 HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞建立過程中使用的gRNA以及PCR引物
1.2.5 單克隆細(xì)胞編輯效果測序鑒定
根據(jù)基因組上的序列,在目標(biāo)基因的編輯位點附近根據(jù)巢式PCR原則設(shè)計檢測PCR引物.并使用Genome Quick Extraction(Epicentre)試劑回收第20天單克隆細(xì)胞基因組.使用設(shè)計好的PCR引物對提取的單克隆基因組進(jìn)行PCR,得到編輯后的目標(biāo)基因序列(500~700bp長度)的PCR產(chǎn)物.再通過的pGEM-T Easy T(ProMega)載體連接系統(tǒng)將PCR產(chǎn)物連接到T載體上.使用TIANGEN產(chǎn)E.coliDH5α將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增,并通過T載體測序結(jié)果確認(rèn)單克隆的編輯情況.測序結(jié)果使用Vector NTI軟件進(jìn)行序列比對.
1.2.6 Western blot
使用SDS-PAGE檢測基因敲除前后HDAC基因家族的蛋白表達(dá)水平.電泳完成后使用轉(zhuǎn)膜儀(BioRad)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.之后使用封閉液(1×TBS+0.5% Tween)進(jìn)行封閉,封閉完成后加入一抗(表2),再加入二抗進(jìn)行雜交(表2),最后使用顯色液(Tanon)進(jìn)行顯色.
表2 HDAC基因家族蛋白分子量及Western blot中使用的抗體
本實驗中使用的CRISPR-Cas9質(zhì)粒是自行設(shè)計的epiCRISPR質(zhì)粒,其基本結(jié)構(gòu)如圖1所示.其中,hU6啟動子起始gRNA的轉(zhuǎn)錄;EFS啟動子起始Cas9、嘌呤霉素抗性基因(puro)和綠色熒光蛋白基因(GFP)的轉(zhuǎn)錄,這3個基因位于同一個閱讀框內(nèi),由2A片段隔開.EBNA1是基因組黏附元件,可以將質(zhì)粒黏附于基因組上,使得質(zhì)粒伴隨著基因組的復(fù)制而復(fù)制,提高質(zhì)粒的表達(dá)效率[8].
圖1 含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)Fig.1 The epiCRISPR system contains two gRNAs(a) 含有雙gRNA的CRISPR系統(tǒng)的構(gòu)建;(b) 雙gRNA插入測序確認(rèn).
我們發(fā)明了在一個epiCRISPR質(zhì)粒上連接2個gRNA的方法.質(zhì)粒上有2個BspQ1酶切位點,位于hU6和tracrRNA之間.如圖1所示,在這個地方插入crRNA1-tracr-hU6-crRNA2序列,就可以表達(dá)2個完整的gRNA.為了實現(xiàn)這個目的,我們設(shè)計了一個中間載體,含有tracr-hU6序列.再設(shè)計一對與tracr-hU6序列匹配的引物,分別含有crRNA1和crRNA2,同時都含有BspQ1酶切位點.經(jīng)過PCR擴(kuò)增就得到了crRNA1-tracr-hU6-crRNA2序列,酶切后就可以連接到epiCRISPR質(zhì)粒上了.
為了進(jìn)一步提高epiCRISPR質(zhì)粒系統(tǒng)的基因敲除效率,我們對原有的epiCRISPR系統(tǒng)進(jìn)行了改造.目的是在epiCRISPR質(zhì)粒上同時表達(dá)2個gRNA,進(jìn)一步提高系統(tǒng)的基因編輯能力.由于Cas9蛋白本身沒有使CRISPR序列成熟的核酸酶功能,必需借助RNAseⅢ的幫助才能切割串聯(lián)的CRISPR序列(等效于串聯(lián)的gRNA+tracr序列),使串聯(lián)的CRISPR成熟,形成可以和Cas9蛋白結(jié)合的gRNA序列[3].所以不能簡單地通過前后串聯(lián)2個gRNA來實現(xiàn)不同的gRNA表達(dá).對于外源的CRISPR/Cas9系統(tǒng)而言,為了形成不同的gRNA,必須使用不同的外源啟動子單獨起始表達(dá)不同的gRNA.因此我們在原有g(shù)RNA插入位置插入了gRNA1+hU6啟動子+gRNA2的片段,形成了2個hU6啟動子分別負(fù)責(zé)gRNA1和gRNA2的轉(zhuǎn)錄.這樣我們在一個質(zhì)粒上就實現(xiàn)了2種gRNA的同時表達(dá)(圖1).
我們設(shè)計的gRNA有如下特點: (1) 2個gRNA之間的堿基數(shù)量不是3的倍數(shù)(表1),如果中間的部分被切掉后,準(zhǔn)確地連接在一起能夠形成移碼突變;(2) 2個gRNA距離很近,都在一個外顯子上,用一對引物就可以檢測編輯的結(jié)果.
為了證明epiCRISPR系統(tǒng)結(jié)合雙gRNA確實能夠增加基因編輯的效率,我們設(shè)計了一組對照實驗.分別使用含有EBNA1元件和雙gRNA的質(zhì)粒1以及含有同樣雙gRNA但是不含有EBNA1元件的質(zhì)粒2(圖2(a))同時轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,按照1.2節(jié)中步驟分別取轉(zhuǎn)染后第5天和第10天樣品進(jìn)行編輯效率檢測.檢測結(jié)果如圖2(b)所示.可以看出在第5天的時候,質(zhì)粒1和質(zhì)粒2的編輯效率沒有明顯區(qū)別(lane 2和4).但是經(jīng)過藥物篩選后的第10天,含有EBNA1的質(zhì)粒1由于質(zhì)粒本身能夠隨著細(xì)胞基因組復(fù)制,因此分裂后的細(xì)胞依然繼承了抗性,因此隨著篩選時間的增加,編輯效率也隨之增加(lane 3).而不含有EBNA1元件的質(zhì)粒2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于質(zhì)粒丟失,細(xì)胞會逐漸被抗性藥物殺死(圖2(c)).雖然第10天的編輯效率才59%(圖2(b)lane 3),但是事實上,由于我們的系統(tǒng)使用的是雙gRNA,根據(jù)之前的文獻(xiàn)[9]研究結(jié)果,使用臨近的雙gRNA對目標(biāo)基因組進(jìn)行編輯的時候,有較高的概率會恰好將2個gRNA中間的片段完全去除,也就是說使用臨近的雙gRNA編輯的結(jié)果中有很多完全相同的編輯,這些相同的結(jié)果會被T7檢測誤判為未編輯.也就是說第10天的編輯結(jié)果要遠(yuǎn)大于59%.
圖2 EBNA1元件增強(qiáng)基因編輯效率Fig.2 EBNA1 enhances gene editing efficiency(a) 質(zhì)粒1和質(zhì)粒2結(jié)構(gòu)示意圖;(b) 基因編輯效率檢測.1. DNA ladder 1000;2. 質(zhì)粒1第5天;3. 質(zhì)粒1第10天;4. 質(zhì)粒2第5天;5. 陰性對照,野生型基因編輯效率檢測;(c) 抗性篩選第10天細(xì)胞拍照,不含有EBNA1元件的細(xì)胞由于質(zhì)粒丟失已經(jīng)完全被抗性藥物殺死(bar=500μm).
HDAC1作為HDAC基因家族的成員之一,在真核生物基因表達(dá)的調(diào)控中起重要作用.HDAC1蛋白是組蛋白乙?;瘡?fù)合體的成分之一[16].并且,HDAC1能夠增強(qiáng)肺上皮細(xì)胞對于A型流感病毒的抵抗[17].HDAC1和肺癌的發(fā)生發(fā)展存在重要的關(guān)聯(lián)[18],HDAC1的敲除對于食道癌的治療也有積極的意義[19].因此,我們嘗試使用結(jié)合了雙gRNA設(shè)計的epiCRISPR系統(tǒng)建立HDAC1純合敲除細(xì)胞系.
根據(jù)圖3(a)所示流程,我們將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到了神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-N-BE(2)中.轉(zhuǎn)染20h后加入puromycin進(jìn)行篩選,篩選后第10天進(jìn)行單克隆分選,之后培養(yǎng)至第20天,選擇能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系進(jìn)行測序和Western blot分析.
從實驗結(jié)果(圖3(c),(d))中可以看出,使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)敲除HDAC1基因,在得到的7個單克隆中,有3個是純合敲除的單克隆(Clone 5,6,7).測序結(jié)果為野生型的Clone1,2,4在對應(yīng)的Western blot泳道中存在明顯的HDAC1蛋白條帶.測序結(jié)果為純合敲除的Clone 5和6在對應(yīng)泳道中沒有HDAC1蛋白的條帶.而另一個測序結(jié)果為純合敲除的Clone 7則表現(xiàn)為部分敲除,可能是因為Clone 7的敲除并不完全,HDAC1仍然有部分表達(dá)(圖3).純合敲除的細(xì)胞生長極其緩慢,說明這個基因?qū)?xì)胞生長很重要.一部分克隆在培養(yǎng)中死掉,推測也是純合敲除造成的結(jié)果.
圖3 HDAC1純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.3 The screening of HDAC1 homozygous knockout(a) HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系篩選流程示意圖;(b) HDAC1雙gRNA設(shè)計以及檢測引物位置;(c) 單克隆測序結(jié)果展示;(d) 單克隆Western blot檢測.紅色框標(biāo)明純合敲除,藍(lán)色框標(biāo)是雜合敲除.
與HDAC1類似,HDAC2是組蛋白乙酰化復(fù)合體的另一個主要成分[16].HDAC2對很多癌癥的耐藥性都具有重要的影響,如對卵巢癌[20]和結(jié)腸癌[21]對化療藥物的敏感性都具有重要作用.
和HDAC1一樣,按照圖3(a)的流程進(jìn)行單克隆篩選,測序之后進(jìn)行Western blot驗證(圖4,見第418頁).實驗結(jié)果表明,和HDAC1類似,使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)進(jìn)行HDAC2純合敲除,篩選的效率也比較高,10個單克隆中得到了2個純合敲除細(xì)胞系(Clone 8,10),這2個細(xì)胞系對應(yīng)的Western blot結(jié)果沒有HDAC2蛋白條帶,說明這2個單克隆做到了HDAC2基因的完全敲除.另外還得到了2個雜合敲除細(xì)胞系(Clone 7,9).相對于野生型細(xì)胞系,雜合敲除的細(xì)胞系中HDAC2蛋白表達(dá)量存在明顯的下降(圖4(d)).純合敲除的細(xì)胞也是生長極其緩慢.
和HDAC1與HDAC2不同,HDAC3并不是組蛋白乙?;瘡?fù)合體的主要組成部分,HDAC3主要在各種炎癥因子相關(guān)的生物反應(yīng)中起作用.HDAC3在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)[22].HDAC3在吸煙引發(fā)的胰腺癌中也具有誘導(dǎo)和促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖的作用[23].同時HDAC3也是一些發(fā)育過程的必要基因,例如,HDAC3是造血干細(xì)胞前體細(xì)胞DNA復(fù)制的必要調(diào)節(jié)基因[24].
但是按照圖3(a)流程,我們無法得到一個穩(wěn)定傳代的HDAC3純合敲除SK-N-BE(2)細(xì)胞系(圖5,見第418頁).存活單克隆的測序結(jié)果全部為野生型.之后,為了驗證這個實驗結(jié)果,我們使用HeLa細(xì)胞按照圖3(a)流程進(jìn)行同樣的HDAC3基因敲除實驗,也無法得一個HDAC3純合敲除HeLa細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未展示).考慮到HDAC3在生物體內(nèi)以調(diào)控炎癥相關(guān)基因并調(diào)節(jié)一些發(fā)育過程中重要前體細(xì)胞的增殖[24],并且有文獻(xiàn)顯示使用Cre重組酶條件敲除HDAC3會導(dǎo)致細(xì)胞分裂S期異常以及DNA損傷修復(fù)異常,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25].而使用類似技術(shù)在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中敲除HDAC3的結(jié)果顯示絕大部分小鼠在出生后24h內(nèi)死亡[26].基于以上結(jié)果,我們認(rèn)為HDAC3是一個純合敲除致死基因,或者嚴(yán)格地說,至少對于SK-N-BE(2)細(xì)胞和HeLa細(xì)胞而言,HDAC3是一個純合敲除致死基因.
圖4 HDAC2純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.4 The screening of HDAC2 homozygous knockout(a) HDAC2雙gRNA設(shè)計以及檢測引物位置;(b) 單克隆測序結(jié)果展示;(c) 單克隆Western blot檢測.紅色框標(biāo)明是純合敲除,藍(lán)色框標(biāo)明是雜合敲除.
圖5 HDAC3純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.5 The screening of HDAC3 homozygous knockout(a) HDAC3雙gRNA設(shè)計以及檢測引物位置;(b) 純合敲除單克隆測序結(jié)果舉例.
和HDAC1,HDAC2不同,HDAC6也不是組蛋白乙?;瘡?fù)合體的組成部分,它主要在細(xì)胞防御與病毒介導(dǎo)方面起作用[27].HDAC6的過量表達(dá)往往會促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖,并增強(qiáng)癌細(xì)胞對于化療藥物的抵抗,這種作用在惡性膠質(zhì)瘤[28]和肺腺體癌[29]中都有過相關(guān)報道.
和HDAC1類似,我們同樣按照圖3(a)的流程對HDAC6基因進(jìn)行純合敲除單克隆篩選,測序之后也進(jìn)行Western blot驗證(圖6).實驗結(jié)果表明,使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)進(jìn)行HDAC6純合敲除,在一輪篩選中得到的5個單克隆中,有2個是純合敲除細(xì)胞單克隆.這依然是一個非常高的比例.
圖6 HDAC6純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.6 The screening of HDAC6 homozygous knockout(a) HDAC6雙gRNA設(shè)計以及檢測引物位置;(b) 單克隆測序結(jié)果展示;(c) 單克隆Western blot檢測.紅色框標(biāo)明是純合敲除,藍(lán)色框標(biāo)明的是雜合敲除.
本實驗利用epiCRISPR表達(dá)雙gRNA的技術(shù),在SK-N-BE(2)細(xì)胞系中對HDAC基因家族進(jìn)行敲除,目的是高效的得到HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系.有報道表明,如果2個gRNA的位置毗鄰的話,則有較大的概率會使得DNA在斷裂處發(fā)生平末端連接而不是indel[30],導(dǎo)致2個gRNA之間的片段丟失,造成移碼突變.并且由于2個臨近的gRNA往往設(shè)計在同一個外顯子上,即使沒有片段丟失,2個gRNA造成閱讀框發(fā)生錯位突變的概率也遠(yuǎn)大于單獨一個gRNA.
HDAC基因家族作為表觀遺傳學(xué)中重要的調(diào)節(jié)基因,通過對組蛋白乙?;降恼{(diào)節(jié)影響多種基因的表達(dá),進(jìn)而參與多種細(xì)胞功能,如細(xì)胞增殖,細(xì)胞凋亡等,這使得HDAC基因家族成為多種疾病的潛在治療靶點.因此,快速有效的建立HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系,是進(jìn)一步研究HDAC基因家族的生物學(xué)功能的必要基礎(chǔ).
最終的實驗結(jié)果中,HDAC1,HDAC2和HDAC6都得到了符合預(yù)期的純合敲除細(xì)胞系,并且純合敲除的比例高達(dá)40%.這個比例和單獨的epiCRISPR實驗[8]以及雙gRNA敲除實驗[9]相比,有了明顯的提高,說明epiCRISPR和雙gRNA敲除這兩種技術(shù)的結(jié)合可以有效地提高獲得純合敲除單克隆的概率.
值得指出的是,我們目前采取的流程是先得到一個穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系再進(jìn)行測序確認(rèn).在實際的操作中,我們發(fā)現(xiàn)很多單克隆在生長和傳代的過程中逐漸死亡.這部分死亡的單克隆并沒有在統(tǒng)計結(jié)果中體現(xiàn).推測這一中途死亡的單克隆里面有較大部分是純合子,而雜合子和野生型的單克隆并不容易死亡.這就導(dǎo)致了我們目前的統(tǒng)計結(jié)果中,純合子的比例要低于實際編輯結(jié)果.因此,如果不考慮HDAC3,目前使用帶有雙gRNA的epiCRISPR質(zhì)粒得到的單克隆中,有接近40%的比例是純合敲除.
與家族中其他基因不同,實驗中HDAC3依然沒有得到穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系.雖然有部分HDAC3純合敲除細(xì)胞系在進(jìn)行單克隆分選的時候能夠存活,但是無一例外的,這些細(xì)胞系都沒有辦法穩(wěn)定傳代,形成可用的單克隆.因此,我們認(rèn)為,至少對于SK-N-BE(2)細(xì)胞系和HeLa細(xì)胞系而言,HDAC3是一個純合致死基因.
在本研究中,我對HDAC家族基因進(jìn)行了敲除實驗,高效快速地得到了HDAC家族基因的純合敲除細(xì)胞系.考慮到CRISPR系統(tǒng)本身的廣泛應(yīng)用性,這種將epiCRISPR系統(tǒng)和雙gRNA技術(shù)結(jié)合起來的方法也能夠適用于其他基因的敲除,可以用于快速構(gòu)建多種基因的純合敲除細(xì)胞系,極大地擴(kuò)展了本實驗技術(shù)的應(yīng)用范圍.