林錦美，段金明，葛晶晶，陳錦芳，占易蒼

(1.集美大學食品與生物工程學院，福建 廈門 361021；2.青島市環(huán)境保護宣傳教育中心，山東 青島 266003；3.廈門三達膜環(huán)境股份有限公司，福建 廈門 361021)

0 引言

近年來，隨著我國工業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的重金屬廢水被排放出來[1]。重金屬廢水大部分具有毒性，且具有持久性、累積性，排放到環(huán)境水體中會導致生態(tài)系統(tǒng)的嚴重破壞，對環(huán)境和人類健康造成極大危害[2-4]。自然界中存在一些微生物，在高濃度金屬條件下，仍能存活或生長，表現(xiàn)出對金屬的抗性。有些菌還能通過生物轉化作用或生理代謝活動使金屬由高毒狀態(tài)變?yōu)榈投緺顟B(tài)，這為微生物法處理重金屬廢水提供了有利條件。相對于傳統(tǒng)方法，微生物法具有環(huán)保、成本低、無二次污染等優(yōu)勢，在重金屬廢水治理中具有良好的發(fā)展前景[5-6]。

微生物對重金屬的抗性機制主要包括胞外沉淀、細胞積累、解毒、生物轉化等[7-10]。由于重金屬是氧供體的一種強競爭離子，具有強氧化特性，在很多生物中都能誘發(fā)產(chǎn)生過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-·)、氫氧自由基(·OH)等活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，對細胞內(nèi)的膜質、蛋白質、DNA 等有很高的反應活性和損傷作用。微生物對重金屬有抗性是因為體內(nèi)存在抗氧化系統(tǒng)。生物系統(tǒng)的抗氧化系統(tǒng)包括抗氧化酶和抗氧化劑?？寡趸钢饕谐趸镝?superoxide dismutase，SOD)和過氧化氫酶(catalase，CAT);抗氧化劑主要有胞內(nèi)的還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)。因此，SOD和GSH可以作為微生物抗重金屬強弱的標準。目前，木霉屬處理含有重金屬的廢水研究已有很多報道[11-12]，主要包括曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)、青霉菌(Penicillium)等，且這些報道主要集中在對重金屬的吸附率、影響吸附率的因素等方面，而對于木霉屬在處理含重金屬廢水，尤其對重金屬抗性性能的研究鮮有報道[11-12]。

本文運用自行篩選、培養(yǎng)、馴化及初步鑒定的擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)，對Cr6+和Ni2+的抗性機制進行初步探索，研究不同重金屬離子對木霉的抗氧化系統(tǒng)及菌量的影響，同時就不同濃度外源NO和SO2對重金屬作用下菌體的抗氧化系統(tǒng)的影響進行研究，為闡明NO/SO2影響重金屬脅迫下菌體生長的生理生化機理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和培養(yǎng)基 擬康寧木霉由集美大學環(huán)境工程實驗室分離鑒定并保存。培養(yǎng)基的制備：實驗采用配好的土豆培養(yǎng)基(m(土豆)∶m(水)=1∶5，葡萄糖25.4 g/L，KH2PO42.1 g/L，MgSO42.1 g/L)滅菌后接種，30 ℃培養(yǎng)3 d。

1.1.2 模擬廢水 Ni2+標準儲備液：準確稱取49.32 g Ni(NO3)·6H2O，用蒸餾水溶解，稀釋定容至1 000 mL，配制質量濃度為10 g/L含Ni2+的標準貯備液，于棕色試劑瓶內(nèi)避光保存。Cr6+標準儲備液：準確稱取28.28 g K2Cr2O7，用蒸餾水溶解，稀釋定容至1 000 mL，配制質量濃度為10 g/L含Cr6+的標準貯備液，于棕色試劑瓶內(nèi)避光保存。本試驗所用銅溶液均由貯備液稀釋得到。

1.2 儀器和試劑

紫外可見分光光度計(UV751GD，上海精密儀器儀表有限公司)，恒溫振蕩器(SHA-C，江蘇省金壇市鴻科儀器廠)，智能生化培養(yǎng)箱(PHX，寧波萊?？萍加邢薰?，臺式高速離心機(H1650，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

重鉻酸鉀(優(yōu)級純)，硝酸鎳(優(yōu)級純)，硝酸(分析純)，氫氧化鈉(分析純)。低粘度樹脂包埋試劑盒Spurr Embedding Kit(北京海德公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 毒性及抗性實驗 將具有抗Cr6+和Ni2+菌株活化24 h后，分別在不同Cr6+、Ni2+濃度的條件下，用接種環(huán)將馴化后的木霉菌種接到液體培養(yǎng)基中，于30 ℃、轉速為120 r/min培養(yǎng)箱里恒溫振蕩培養(yǎng)3 d，然后將培養(yǎng)后的菌液置于抽濾機內(nèi)以0.05 MPa壓力抽濾，并用去離子水反復清洗，最后將得到的菌種置于65 ℃烘箱內(nèi)24 h烘干，用電子天平稱其干重以表示細菌的生長量，并測定獲得的菌粉中GSH和SOD含量。

1.3.2 GSH提取及其測定 參照文獻[13]采用熱水抽提法。取1 g烘干的菌粉,與4 mL蒸餾水充分混合后倒入5 mL沸騰的水中,充分混合后放入95～100 ℃水浴鍋中水浴10 min后，立即取出放于冰水中速冷，然后在轉速為5 000 r/min下離心10 min，取出上清液，用碘量法測定GSH的含量。

1.3.3 SOD提取及測定 每毫克組織蛋白質在1 mL反應液中SOD抑制率達 50%時所對應的SOD量作為一個SOD活力單位(U)。培養(yǎng)后的菌液經(jīng)離心沉淀后用考馬斯亮蘭法(蛋白質試劑盒，南京建成生物工程研究所)測定出組織中蛋白質含量。每個體系取3個試樣作為平行實驗，并計算酶液的可溶性蛋白質含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗均重復3次，取平均值，并運用Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理與圖表繪制。采用Excel進行方差分析，顯著性水平為0.05。

2 結果

2.1 Cr6+和Ni2+對擬康寧木霉的毒性

在含有不同重金屬溶液中接種擬康寧木霉進行毒性分析試驗，結果如圖1所示。由圖1可見，在重金屬Cr6+和Ni2+的脅迫下，菌體的生長均受到嚴重影響，2種重金屬對擬康寧木霉的生長始終表現(xiàn)出抑制作用。說明重金屬對菌體有一定毒性作用，且Cr6+對菌體的毒性強于Ni2+。當Cr6+質量濃度從0升高到150 mg/L時，擬康寧木霉的生長量顯著下降，同時，菌體內(nèi)GSH的含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，并且在Cr6+的質量濃度為100 mg/L時達到最高。Ni2+對擬康寧木霉的影響跟Cr6+相似，當Ni2+質量濃度從0升高到300 mg/L時，菌體的生長量迅速降低，而菌體內(nèi)GSH的含量先增加后減少，且在Ni2+質量濃度為100 mg/L時，GSH的含量達到最高。由此可知，重金屬的存在能夠誘導擬康寧木霉體內(nèi)產(chǎn)生GSH來減小對其的毒性作用。

2.2 外源NO對Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉抗性

2.2.1 外源NO對Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉生長量的影響

本實驗通過測定NO的供體硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)[14]的濃度來反映NO對Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉生長的影響，結果見圖2。由圖2可知，在沒有Cr6+和Ni2+時，SNP濃度由0增加到0.1 mmol/L時，擬康寧木霉的生長量沒有變化；SNP濃度由0.1 mmol/L增加到0.3 mmol/L時，擬康寧木霉的生長有所抑制。當Cr6+和Ni2+質量濃度增加到50 mg/L時，Cr6+和Ni2+對擬康寧木霉的生長均呈現(xiàn)一定的抑制作用，但是加入0.1 mmol/L的SNP，菌體的生長量反而增加，SNP增加到0.3 mmol/L時，菌體的生長量有所降低。當Cr6+和Ni2+質量濃度為150 mg/L時，結果類似。說明一定濃度的NO能夠降低Cr6+和Ni2+對菌體的毒性作用，促進菌體的生長，但NO濃度過高，卻不利于菌體的生長。

2.2.2 外源NO對Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉GSH含量的影響

本實驗研究了不同外源NO濃度對擬康寧木霉中GSH含量的影響，結果如圖3所示。由圖3可以看出，在含有Cr6+的條件下，當SNP濃度由0升高到0.2 mmol/L時，菌體內(nèi)GSH含量也隨之升高。繼續(xù)升高SNP濃度，菌體內(nèi)GSH的含量迅速降低。由此表明，一定濃度的外源NO能夠促進菌體內(nèi)GSH含量的增加，從而抵抗菌體對Cr6+和Ni2+的毒性。在Ni2+的條件下，結果和Cr6+的情況類似，當SNP濃度由0升高到0.3 mmol/L時，菌體內(nèi)GSH含量也隨之升高，繼續(xù)升高SNP濃度，菌體內(nèi)GSH的含量降低。這說明，一定濃度的外源NO能夠促進菌體內(nèi)GSH含量的增加，從而抵抗菌體對Cr6+和Ni2+的毒性，但是NO濃度太高時，反而會起抑制作用。

2.2.3 外源NO對Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉SOD活性的影響

本實驗研究了不同濃度的外源NO對擬康寧木霉SOD活性的影響，結果如圖4所示。從圖4中可以看出，在不存在重金屬Cr6+和Ni2+的條件下，菌體中SOD的活性很低。這是因為沒有重金屬的誘導，不會激發(fā)菌體中SOD的活性來抵抗重金屬的毒性。在沒有外源NO的加入時，隨著Cr6+和Ni2+濃度的增加，菌體內(nèi)SOD的活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且重金屬Cr6+和Ni2+質量濃度分別為120，150 mg/L時，菌體內(nèi)SOD活性最高。這說明一定濃度重金屬，可以激發(fā)菌體中SOD的活性來抵抗重金屬的毒性，但是重金屬濃度太高，對菌體的毒害作用太大，所以菌體內(nèi)SOD的活性反而會降低。當加入外源NO時，菌體中SOD的活性隨著外源NO濃度的升高呈現(xiàn)先增強后降低的趨勢，且在NO濃度為0.5 mmol/L時，SOD活性最高。這表明，低濃度外源NO可以促進菌體內(nèi)SOD活性增強，而高濃度的外源NO對菌體內(nèi)SOD活性卻存在抑制作用。

2.3 外源SO2對Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉抗性

本實驗分別研究了在Cr6+和Ni2+初始質量濃度為0，50，100 mg/L時不同濃度外源SO2對菌體內(nèi)GSH含量及SOD活性的影響，結果見圖5。由圖5可以看出，在Cr6+脅迫的菌體中，當外源SO2濃度由0增加到0.5 mmol/L時，GSH的含量及SOD的活性迅速降低，而隨著外源SO2濃度由0.5 mmol/L升高到1.0 mmol/L時，菌體內(nèi)GSH的含量下降速度有所減緩，說明SO2對菌體中GSH合成及SOD活性產(chǎn)生抑制作用?？赡茉蚴牵和庠碨O2在菌體上發(fā)生了氧化反應，此過程產(chǎn)生了大量的活性氧，加速了菌體的氧化損傷，抑制了菌體內(nèi)GSH的合成及SOD的活性。

2.4 Cr6+和Ni2+對擬康寧木霉的毒性和抗性相關性分析

通過對不同濃度Cr6+和Ni2+對擬康寧木霉的毒性和抗性相關性分析表明，不同濃度重金屬脅迫下， Cr6+毒性和抗性相關系數(shù)為-0.758 8(P<0.05)，表現(xiàn)出顯著負相關；而Ni2+毒性與抗性相關系數(shù)為-0.298 7，其負相關性不明顯。外源NO條件下Cr6+和Ni2+對擬康寧木霉抗性相關性分析結果見表1。由表1可知，在不同Cr6+和Ni2+濃度脅迫下，低濃度外源NO中的GSH與SOD表現(xiàn)出較顯著的正相關性(P<0.05)，高濃度外源NO中的GSH與SOD相關性不顯著。

表1 外源NO對不同濃度Cr6+和Ni2+脅迫下擬康寧木霉抗性GSH/SOD相關性

3 討論

關于木霉處理廢水的研究已有一些報道，如李會東等用木霉處理含鉻廢水，在28 ℃、pH值為1的環(huán)境條件下，其對Cr6+的吸附率高達99%[15]。但這些研究大多集中在生物吸附方面，而對于其抗重金屬機制的研究并沒有深入進行。本研究發(fā)現(xiàn)，擬康寧木霉在處理重金屬廢水時體內(nèi)GSH的含量及SOD的活性發(fā)生顯著的變化，在Cr6+和Ni2+脅迫下，GSH的含量及SOD的活性明顯高于無Cr6+和Ni2+脅迫下的。當存在Cr6+和Ni2+時，Cr6+和Ni2+誘導菌體產(chǎn)生GSH和增強SOD的活性，從而抵抗重金屬的毒性，這跟陳葉福等[16]的研究結果類似。然而，在重金屬誘導下，擬康寧木霉是通過什么途徑合成GSH并提高SOD的活性的，本文并沒有深入研究。從分子和代謝水平闡明GSH的合成機制和途徑，可能成為未來的研究重點。另外，高濃度Cr6+和Ni2+對擬康寧木霉有明顯的抑制作用，而實際中有一些工業(yè)廢水如電鍍廢水、冶金廢水等，其重金屬離子濃度極高，這對微生物處理提出新的挑戰(zhàn)。因此，如何提高微生物對重金屬離子的抗性，就顯得尤為迫切。也許通過基因工程構建工程菌，為我們提供了一條可行的途徑。

NO是一種廣泛分布于生物體內(nèi)的氣體活性分子。有研究表明[17]，外源NO能夠提高鹽脅迫下種子的萌發(fā)，延緩果實等器官的成熟和衰老，以及參與植物抗病反應等,在植物體內(nèi)對各種生物和非生物脅迫反應的信息傳遞發(fā)揮著重要的作用。但是外源NO濃度過高對生物體也具有毒害作用,NO對生物體的代謝具有雙重性[17-19]。而NO對微生物抗重金屬脅迫的研究，目前鮮有報道。本文研究了不同外源NO濃度對擬康寧木霉抗重金屬的影響，結果顯示，低濃度NO有利于菌體內(nèi)GSH的合成及SOD活性的提高，從而抵抗重金屬的毒性，而高濃度外源NO反而有抑制作用。這說明，NO不僅能夠調節(jié)植物對重金屬脅迫下的抗性強弱，對微生物也有相似的作用。但是關于NO如何調節(jié)微生物的抗性，目前仍不清楚。本實驗從NO調節(jié)菌體中GSH的合成及SOD的活性來初步闡述了NO對微生物抗重金屬的機制，但是具體的分子機制還有待進一步研究。

4 結論

1)在Cr6+和Ni2+的作用下，隨著重金屬濃度增加，擬康寧木霉菌生長量逐漸減少，GSH含量先增加后減少。說明重金屬誘導菌體生成GSH，緩解重金屬對細胞的氧化損傷作用，而Cr6+脅迫下，菌量與GSH呈現(xiàn)顯著的負相關性，Ni2+脅迫下，菌量與GSH的負相關性不顯著。重金屬Cr6+對木霉的毒性作用強于Ni2+。

2)低濃度外源NO能夠增加菌體內(nèi)GSH含量及SOD的活性，從而緩解重金屬脅迫對菌體的氧化損傷作用，且二者呈現(xiàn)正相關性(P<0.05)；高濃度外源NO則加重重金屬對菌體的損傷作用，GSH/SOD相關性不顯著。

3)在不同濃度外源SO2作用下，GSH的含量和SOD的活性均隨外源SO2濃度的增加而降低，說明外源SO2加劇重金屬對菌體的損傷作用。