孟建宇， 徐慧欣， 納荷芽

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特010011）

青貯飼料是將含水率為65%～75%的青綠飼料經(jīng)切碎后，在密閉缺氧的條件下，通過厭氧乳酸菌的發(fā)酵作用，抑制各種雜菌的繁殖，得到的一種粗飼料（玉柱和孫啟忠，2011；張玉婷和胡柏林，2008）。青貯飼料可為家畜提供具有良好營養(yǎng)和口感的冬季青綠飼料，還可以解決大量秸稈廢棄物帶來的環(huán)境問題。為進(jìn)一步改善青貯飼料的口感和營養(yǎng)，越來越多的研究將重點(diǎn)放在生物性青貯添加劑上（丁琳等，2017；侯美玲，2017），尤其是微生物制劑和纖維素酶制劑的添加已成為牧草營養(yǎng)學(xué)中的研究熱點(diǎn) （黃勤樓等，2017；原現(xiàn)軍等，2013）。

纖維素酶可將秸稈纖維類組分進(jìn)行降解，降低纖維含量，增加乳酸菌發(fā)酵所需的底物，生成乳酸，降低pH，抑制有害菌的生長(zhǎng)，減少營養(yǎng)物質(zhì)的損失，并利用菌群代謝的各類活性物質(zhì)調(diào)節(jié)動(dòng)物的免疫等，以改善青貯飼料的品質(zhì)（丁琳等，2017；宋鴿等，2017；趙士萍等，2016；Guo，2014）。纖維素酶產(chǎn)生菌通過產(chǎn)生纖維素酶，降解飼料中難以利用的纖維素為單糖或雙糖等可溶性糖，為乳酸菌、酵母菌的發(fā)酵提供更多的糖分，從而有助于其在青貯中發(fā)揮自身有益作用，促進(jìn)青貯發(fā)酵（郭威等，2017）。

目前用于青貯飼料研究與應(yīng)用的纖維素酶主要來源于真菌，但所應(yīng)用的菌株仍存在纖維素降解能力低、活性不夠穩(wěn)定、產(chǎn)酶成本較高和pH作用范圍小等問題。因此，獲得高效降解纖維素的菌株對(duì)提高青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)及利用率具有重要的意義（黃勤樓等，2017）。本試驗(yàn)以青貯飼料為研究對(duì)象，通過富集培養(yǎng)（李詳和黃勇，2010；張晶，2007）富集樣品中的纖維素降解菌，在CMC-Na培養(yǎng)基上分離純化，由16S rDNA序列分析法對(duì)篩選到的纖維素降解菌進(jìn)行鑒定，為今后的纖維素降解菌在青貯飼料中的高效利用提供更多的基礎(chǔ)信息和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品 青貯飼料由內(nèi)蒙古天寶生物科技有限公司提供。

1.2 培養(yǎng)基 CMC-Na培養(yǎng)基：羥甲基纖維素鈉5.0 g/L，MgSO40.5 g/L，KH2PO42.0 g/L， 酵母抽提物 2.0 g/L，瓊脂 20 g/L， 蒸餾水 1000 mL，pH 8.8，121℃滅菌 30 min。

1.3 菌種的富集篩選和分離純化 將青貯飼料樣品用無菌水振蕩浸提過夜，吸取上清液注入到富集培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱中28℃倒置培養(yǎng)3周。從富集培養(yǎng)瓶中吸取菌液，然后進(jìn)行稀釋，將稀釋好的四個(gè)梯度（10-2、10-3、10-4、10-5）的菌懸液分別吸取1 mL，加到CMC-Na（自然pH）培養(yǎng)基平板上，用涂布器涂布均勻，在恒溫培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)2～3 d后，挑取單菌落再于培養(yǎng)基上劃線純化，重復(fù)以上步驟直到得到純的單菌落。

1.4 菌種的16S rDNA序列分析 純菌DNA的提取參考胡曉紅等（2008）的方法。選用細(xì)菌通用引物對(duì)27F（5'-TACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATA-3'） 和 1492R （5'-AGTAAGGAGGTGATCCAACCGCA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物采用SYBR GreenⅠ作為標(biāo)記，在1%（W/V）瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳測(cè)定。以Marker DL2000作為對(duì)照，在紫外燈下觀察DNA譜帶，照相。將PCR產(chǎn)物交由北京華大公司測(cè)序。獲得的核酸序列用GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行Blast相似性比較。

1.5 酶活的測(cè)定 采用DNS法 （段杰，2015）對(duì)纖維素降解菌的酶活進(jìn)行測(cè)定。將分離得到的單菌落接種于液體培養(yǎng)基，在常溫條件下?lián)u菌三天。吸取振蕩渾濁的菌夜2 mL，在3000 r/min，常溫下離心3 min后，吸取1 mL的上清液即粗酶液于試管中，加1mL 1.0%的CMC緩沖液后于50℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，取出后加入2.5 mL DNS試劑，于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后用1 cm比色皿在540 nm下測(cè)定其OD值，查閱葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算含糖量。按照IUPAC推薦的國際標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定，以IU/mL表示。一個(gè)酶活性單位（IU）定義為1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化底物產(chǎn)生1.0 μmol還原糖 （以葡萄糖計(jì)）所需的的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的分離篩選 經(jīng)過反復(fù)劃線分離 純 化 ， 得 到 Gs7、Gs10、Gs3、Gs9、Gs11-2 和Gs12六株降解纖維素的細(xì)菌。其中，菌株Gs3、Gs7、Gs9和Gs12的菌落形態(tài)特征基本相同，為圓形凸起，乳白色，邊緣光滑且光澤不透明；Gs10的菌落形態(tài)特征為圓形凸起淡黃色，邊緣光滑且有光澤不透明；Gs11-2的菌落形態(tài)特征為均勻圓形凸起，乳白色（表 1）。

表 1 菌株 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10、Gs11-2、Gs12的菌落形態(tài)特征

2.2 菌株的鑒定 以細(xì)菌16S rDNA通用引物27F 和 1492R 對(duì)菌株 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10、Gs11-2和Gs12的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度約為1500 bp，符合預(yù)期片段長(zhǎng)度，為目的片段。用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序?qū)Λ@得的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)6株纖維素降解細(xì)菌分別來源于2個(gè)不同的屬， 即 Gs3、Gs7、Gs9、Gs10 和 Gs12 均屬于乳桿菌屬 （Lactobacillus），Gs11-2屬于醋菌屬（Acetobacter），其同源性都為 100%（表 2）。

圖1 菌株的16S r DNA片段的擴(kuò)增結(jié)果

表2 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

2.3 菌株的酶活測(cè)定 采用DNS法對(duì)分離到的6株纖維素降解細(xì)菌的纖維素酶活進(jìn)行了測(cè)定。菌株Gs3的相對(duì)酶活為36.20 IU，菌株Gs7的相對(duì)酶活為24.24 IU，菌株Gs9的相對(duì)酶活為61.70 IU，菌株Gs10的相對(duì)酶活為35.57 IU，菌株Gs11-2的相對(duì)酶活為25.50 IU，菌株Gs12的相對(duì)酶活為35.89 IU。

3 結(jié)論

纖維素酶廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、棉紡、環(huán)保及可再生資源利用等領(lǐng)域，其是一種安全、高效的生物催化劑，可水解纖維素、半纖維素成為可被動(dòng)物或乳酸菌利用的糖，有利于發(fā)酵，降低青貯料中的粗纖維，同時(shí)釋放出細(xì)胞內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)，提高有機(jī)物利用率，從而改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值和消化利用率（黃勤樓等，2017；廖奇等，2017；趙士萍等，2016）。自然界中能夠產(chǎn)生降解纖維素酶及降解作物纖維素的微生物很多，因此，纖維素降解菌的篩選是纖維素酶制劑生產(chǎn)及應(yīng)用過程中最基礎(chǔ)的工作。本文從內(nèi)蒙古的青貯飼料中分離得到了6株纖維素降解細(xì)菌，經(jīng)16S rDNA序列分析，Gs3、Gs7、Gs9、Gs10 和 Gs12 均 屬 于 乳 桿 菌 屬（Lactobacillus），Gs11-2 屬 于 醋 菌 屬 （Acetobacter）。其中，Gs9的纖維素酶活較高，為61.70 IU，是一株可應(yīng)用于飼料微貯的微生物制劑參考菌株，值得進(jìn)一步研究。