柯 煒 ，葉志華

（1. 武穴市第一人民醫(yī)院，湖北 武穴 435400；2. 鄂東醫(yī)療基團(tuán)黃石中心醫(yī)院（湖北理工學(xué)院附屬醫(yī)院），湖北 黃石 435000）

精索靜脈曲張（varicocele，VC）是泌尿外科 中比較常見的疾病，表現(xiàn)為蔓狀靜脈和精索內(nèi)靜脈異常擴(kuò)張、伸長和迂曲，多見于青壯年，以左側(cè)多見，發(fā)病率約為15 %，在導(dǎo)致男性不育癥的病因中居首位[1]。其機(jī)制較復(fù)雜，可能與睪丸微循環(huán)、血管活性物質(zhì)、氧化應(yīng)激、一氧化氮、缺氧、免疫及凋亡等多種因素有關(guān)。硫化氫（H2S）作為一個(gè)新型的氣體信號分子，在多種器官的損傷過程中,發(fā)揮廣泛的保護(hù)作用[2]。本研究通過建立大鼠VC模型，觀察外源性H2S對睪丸生精功能的影響，為VC的防治提供新的手段。

1 材料與動物

1.1 材料

NaHS（H2S外源性供體，Sigma 公司）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒，超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成）；原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（德國羅氏）；Caspase-3，Bax抗體（加拿大圣克魯斯公司）；免疫組化檢測試劑盒（福建邁新）；RNA 提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（威佳科技）。

1.2 動物

36只成年健康雄性SD大鼠，體重250～280 g，購于湖北省疾病預(yù)防與控制中心。

2 方法

2.1 動物分組與造模

SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組12只。實(shí)驗(yàn)前，所有大鼠飼養(yǎng)在恒定溫度的房間（22±2 ℃），給予相同的食物和水。采用2 %戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉,常規(guī)消毒鋪單，腹正中切口。假手術(shù)組：左腎靜脈暴露后，僅分離而不結(jié)扎，4-0絲線縫合切口；模型組：仔細(xì)分離腎上腺靜脈和精索靜脈內(nèi)側(cè)的左腎靜脈段，在左腎靜脈上平行放置一直徑約0.4 mm的光滑的金屬桿，并用4-0絲線結(jié)扎，使左腎靜脈直徑縮窄為原來的一半后將金屬桿拉出，使左腎靜脈復(fù)通。4周后，左精索靜脈異常擴(kuò)張，同時(shí)左腎無明顯病理性萎縮，為VC模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)；外源性硫化氫組：在模型組成功建立的基礎(chǔ)上，同時(shí)于腹腔注射NaHS[20 mg/(kg·d)]。VC術(shù)后4周，取各組大鼠左側(cè)睪丸，仔細(xì)剪除附著的脂肪組織和筋膜，生理鹽水沖洗后以濾紙拭干，縱向?qū)⑵淝谐蓛砂?，一半組織用于組織學(xué)檢查，常規(guī)HE染色，觀察睪丸組織的形態(tài)學(xué)改變；另一半組織放置液氮中冷凍后放置-80 ℃冰箱保存。

2.2 MDA和SOD測定

冷凍的睪丸組織勻漿、離心（3000 r/min，12 min）后收集上清。按試劑盒說明書，采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量（nmol/g蛋白），采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性（U/mg蛋白）。

2.3 生精細(xì)胞凋亡檢測

利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測生精細(xì)胞凋亡，細(xì)胞核染成棕黃色者為陽性細(xì)胞，光鏡下（×200）每張切片選取10個(gè)連續(xù)不重疊的視野，計(jì)算細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞數(shù)。凋亡指數(shù)（AI）=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100 %。

2.4 免疫組化

采用免疫組化染色分析Caspase-3和Bax的表達(dá)。組織用4 %多聚甲醛固定，石蠟包埋后切片，厚4 μm。按說明書指示進(jìn)行，加入Caspase-3、Bax抗體及相應(yīng)二抗，PBS洗滌后DAB顯色5 min后封片，顯微鏡下棕褐色為陽性染色。

2.5 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

取冷凍睪丸組織樣本提取總R N A。取1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用PCR基因擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)方案依據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行，引物序列如下：Caspase-3正義鏈5’-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3’，反義鏈5’-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3’；Bax正義鏈5’-GCCTCCTGACTCCAGGTCC-3’，反義鏈5’- GTGCAGGGTCCG AGGT-3’； GAPDH正義鏈5’-TGCTATGTTGCCCTAGAC-3’，反義鏈5’-GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG-3’。軟件分析各組的循環(huán)閾值（Ct），最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析，得出各組基因mRNA表達(dá)量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；計(jì)數(shù)資料比較采用 χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 睪丸組織的病理學(xué)改變

假手術(shù)組未見明顯的組織病理學(xué)改變，可見各級生精細(xì)胞排列有序，管腔有大量精子；模型組可見曲細(xì)精管管腔間隙明顯增大，各級生精細(xì)胞排列紊亂且廣泛脫落；外源性硫化氫組可見生精細(xì)胞排列正?；蜉p度紊亂，少數(shù)腔內(nèi)見脫落的生精細(xì)胞（見圖1）。

圖1 睪丸組織病理學(xué)改變

3.2 睪丸組織中MDA含量和SOD活性變化

模型組MDA含量較假手術(shù)組明顯增加，外源性硫化氫組MDA含量較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與假手術(shù)組相比，模型組SOD活性顯著降低，H2S處理后增加了睪丸組織中SOD的活性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見表1）。

表1 睪丸組織中MDA含量與SOD活性的變化（±s，n=12）

表1 睪丸組織中MDA含量與SOD活性的變化（±s，n=12）

注：*P＜0.05 vs 假手術(shù)組，#P＜0.05 vs 模型組

組別 MDA含量/nmol·g-1 SOD活性/U·mg-1假手術(shù)組 1.64±0.39 0.72±0.04模型組 4.32±0.86* 0.19±0.02*外源性硫化氫組 2.65±0.43*# 0.56±0.03*#

3.3 睪丸生精細(xì)胞凋亡情況

假手術(shù)組可見較少的睪丸生精細(xì)胞凋亡；模型組凋亡細(xì)胞明顯增加，與假手術(shù)組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，外源性硫化氫組生精細(xì)胞凋亡明顯減少，各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 睪丸組織生精細(xì)胞凋亡指數(shù)（±s，n=12）

表2 睪丸組織生精細(xì)胞凋亡指數(shù)（±s，n=12）

注：*P＜0.05 vs 假手術(shù)組，#P＜0.05 vs 模型組

假手術(shù)組 3.78±0.27模型組 16.53±1.25*外源性硫化氫組 8.48±0.72*#

3.4 睪丸組織中Bax與Caspase-3的表達(dá)

免疫組化染色檢測睪丸組織Bax、Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果顯示假手術(shù)組僅可見生精細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中散在的陽性表達(dá)；模型組中，其陽性表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核呈黃色或棕黃色；外源性硫化氫組陽性表達(dá)較模型組明顯減少，見圖2。RT-PCR法檢測Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平，與假手術(shù)組相比，模型組Bax、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平顯著升高；與模型組相比，外源性硫化氫組Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖2 睪丸組織Bax和Caspase-3免疫組化圖

圖3 睪丸組織中Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)

4 討論

H2S是繼內(nèi)源性一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三種氣體信號分子，無色，有臭雞蛋氣味，可溶于水及脂溶性溶劑，在體內(nèi)以H2S/NaHS的形式保持動態(tài)平衡[3]。研究顯示，大部分生物和藥理實(shí)驗(yàn)中，硫氫化鈉（NaHS）被用作H2S的供體，在水中溶解后短時(shí)間內(nèi)即釋放出大量H2S，具有抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用[4-5]。Liang等[6]發(fā)現(xiàn)一定濃度的外源性H2S可通過阻斷TLR4通路，減少心肌細(xì)胞的炎性損傷。Guan等[7]報(bào)道了H2S可明顯減少氧自由基生成，從而對急性肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。Hosgood等[8]使用無心跳供體的豬腎移植模型觀察外源性H2S對腎缺血再灌注損傷的作用，發(fā)現(xiàn)使用H2S可明顯降低血肌酐并能改善再灌注后腎功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用HE染色觀察VC對大鼠睪丸組織學(xué)變化的影響，結(jié)果顯示：模型組中睪丸曲細(xì)精管管腔間隙明顯增大，各級生精細(xì)胞排列紊亂，且生精細(xì)胞出現(xiàn)廣泛脫落現(xiàn)象，這嚴(yán)重影響了睪丸結(jié)構(gòu)及生精功能；外源性H2S治療后明顯改善了VC引起的組織學(xué)損傷。

氧化應(yīng)激是活性氧自由基過量產(chǎn)生，從而致抗氧化機(jī)制破壞的結(jié)果。過量的氧自由基可與細(xì)胞內(nèi)重要的分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸等發(fā)生反應(yīng)，破壞了其正常的功能，導(dǎo)致一系列細(xì)胞功能障礙或死亡[9-10]。哺乳動物的睪丸對氧化應(yīng)激水平高度敏感，VC過程與氧自由基過度產(chǎn)生緊密相關(guān)[11]。正常情況下，SOD是細(xì)胞生長、分化過程中的重要組成部分，可催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫，其活性反映了機(jī)體氧自由基清除的能力；而MDA是脂質(zhì)氧化的一種重要產(chǎn)物，通常可作為評價(jià)氧化應(yīng)激水平的標(biāo)志物[12]。研究發(fā)現(xiàn)，H2S可明顯減少機(jī)體內(nèi)氧自由基的生成，在預(yù)防多個(gè)系統(tǒng)器官的氧化應(yīng)激損傷中具有治療潛力[13]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，H2S處理后，可使VC睪丸組織中的SOD活性明顯升高，MDA含量降低，這表明外源性H2S對VC睪丸的氧化應(yīng)激損傷產(chǎn)生了保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是一種基于遺傳學(xué)機(jī)制的正常生理現(xiàn)象，是通過誘導(dǎo)一系列形態(tài)和生化改變導(dǎo)致細(xì)胞死亡的過程[14]。同時(shí)，細(xì)胞凋亡也是生精過程中一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，在維持精子發(fā)生的動態(tài)平衡中起著重要的作用，凋亡過程的改變會使生精細(xì)胞發(fā)生異常凋亡，從而引起不育[15]。VC引起的損傷具有復(fù)雜的病理過程,凋亡是缺血、缺氧性損傷發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。Zheng等[16]在大鼠VC模型中發(fā)現(xiàn)，睪丸生精細(xì)胞凋亡較術(shù)前明顯增加，且損傷程度與損傷時(shí)間呈正相關(guān)，從而引起睪丸功能受損致男性不育。在人類凋亡通路級聯(lián)反應(yīng)中，Caspase-3和Bax是細(xì)胞凋亡機(jī)制中必不可少的組成部分。當(dāng)機(jī)體接受凋亡刺激時(shí)，其激活可引起細(xì)胞底物的降解并參與多種發(fā)病機(jī)制，如睪丸生精障礙，精子活力和精子DNA水平降低等[17]。其中，Bax是Bcl-2家族的主要蛋白之一，它可促進(jìn)cytc從線粒體釋放，從而引起細(xì)胞凋亡；Caspase-3 是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵效應(yīng)酶，同時(shí)也是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點(diǎn)，它的活化是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的標(biāo)志[18]。Bos等[19]發(fā)現(xiàn)外源性H2S可抑制Caspase-3的激活，從而達(dá)到抗凋亡作用。還有研究顯示，通過建立雄激素缺乏模型，發(fā)現(xiàn)睪丸組織中生精細(xì)胞凋亡引起睪酮的降低是Caspase-3依賴性的，表明Caspase-3激活參與并誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡[20]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒MCaspase-3、Bax的表達(dá)明顯高于假手術(shù)組, 其生精細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高；經(jīng)H2S處理后，其表達(dá)及細(xì)胞凋亡指數(shù)較模型組明顯降低。以上結(jié)果證明H2S對VC引起的睪丸生精細(xì)胞產(chǎn)生抗凋亡作用。

綜上所述，H2S可減輕氧化應(yīng)激水平和抑制凋亡，從而對VC睪丸生精功能發(fā)揮保護(hù)作用，其作用機(jī)制還需深入研究。