劉迪迪，邱軍強，程翠林，王振宇

（哈爾濱工業(yè)大學(xué) 化工與化學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是Ⅱ型糖尿病的主要致病因素，其特征為機體靶組織對胰島素反應(yīng)不敏感，外周組織利用葡萄糖水平下降，肝臟細胞不能有效抑制糖異生和糖原分解，即胰島素抑制肝臟葡萄糖輸出能力下降，造成血糖調(diào)節(jié)能力紊亂[1-2]。研究表明，機體胰島素抵抗還易引發(fā)并促進肥胖癥、高血壓、心血管及動脈粥樣硬化等代謝疾病的發(fā)生和發(fā)展[3-4]。

從食品或中草藥中篩選有效活性成分來改善胰島素抵抗，治療相關(guān)疾病已成為研究的熱點[5-10]。建立穩(wěn)定可靠的人體外IR細胞模型不僅便于篩選防治IR的有效藥物及活性成分，還可在細胞及分子水平探索IR發(fā)病機制[11]。

肝臟是糖代謝最主要器官之一，對維持血糖穩(wěn)定有重要作用。HepG2細胞來源于肝細胞，是一種表型與肝細胞極為相似的肝胚胎瘤細胞株，保留了肝細胞的許多生物學(xué)特性，因此，HepG2細胞是建立體外胰島素抵抗模型的理想之選[12]。

目前相關(guān)研究中普遍以高濃度胰島素為模型誘導(dǎo)劑，但文獻報道中，胰島素誘導(dǎo)濃度及作用時間存在一定差異[13-18]，且缺乏更為詳細系統(tǒng)的研究，培養(yǎng)基中是否含血清也很少有明確說明，而諸多因素均會影響到HepG2細胞對葡萄糖的消耗及細胞活性，進而影響胰島素抵抗細胞模型的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性，因此，本試驗展開系統(tǒng)研究，為建立可靠穩(wěn)定的胰島素抵抗細胞模型提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；SWCJ-1F單人雙面凈化工作臺（上海藍豹實驗儀器公司）；XDS-1B倒置生物顯微鏡（上海精密儀器儀表公司）；mindray MR-96A酶標(biāo)儀（深圳邁瑞）。

1.2 材料與試劑

人肝癌細胞（HepG2，哈爾濱腫瘤醫(yī)院）；牛胰島素（INS，源葉生物）；噻唑藍（MTT），RPMI Medium 1640培養(yǎng)基，滅活胎牛血清（FBS），胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液（PBS，Solarbio公司）；葡萄糖測定試劑盒（葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法，上海榮盛）。

2 方法

2.1 HepG2細胞的培養(yǎng)[19]

HepG2細胞復(fù)蘇，轉(zhuǎn)入100 ml細胞培養(yǎng)瓶中，用含10 % FBS的1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5 % CO2條件下無菌培養(yǎng)。當(dāng)細胞貼壁長滿后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗滌細胞，再以0.25 % 胰蛋白酶消化，傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。

2.2 HepG2細胞培養(yǎng)及分組

將處于對數(shù)生長期的細胞消化后，以含10 %FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為105個/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl繼續(xù)培養(yǎng)，每塊板均分為空白組（無細胞）、對照組（無胰島素刺激，正常培養(yǎng)細胞）及模型組。待24 h細胞單層貼壁后，棄去含血清培養(yǎng)基，并以PBS洗滌，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，空白組、對照組加無血清培養(yǎng)基，模型組則加入以無血清培養(yǎng)基配制的胰島素培養(yǎng)液，胰島素終濃度分別為5×10-9，5×10-8，5×10-7，5×10-6、5×10-5mol/L，每組10個復(fù)孔，每孔100 μl。

2.3 HepG2細胞對葡萄糖的消耗試驗[18,20]

考察不同胰島素濃度及作用時間對細胞消耗葡萄糖的影響：于37 ℃ ，5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育72 h，每12 h取培養(yǎng)基上清，葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法檢測葡萄糖含量，按下式計算葡萄糖消耗量。

式中：ΔGC為各組細胞的葡萄糖消耗量；GC0為未接種細胞的空白組中葡萄糖含量；GCx為測得各組培養(yǎng)液中葡萄糖含量。

2.4 模型穩(wěn)定性研究試驗

胰島素作用48 h后，棄去含胰島素的培養(yǎng)基，每孔以PBS洗滌1次，兩塊板分別加入無血清培養(yǎng)基及含10 %血清培養(yǎng)基100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24，48，72 h取上清培養(yǎng)基測定葡萄糖消耗情況，每24 h更換一次培養(yǎng)基。按2.3項公式計算葡萄糖消耗量。

2.5 細胞增殖試驗

葡萄糖消耗試驗結(jié)束后，移出培養(yǎng)液，每孔加入5 mg/ml MTT溶液10 μl，37 ℃培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入 DMSO 150 μl，用酶標(biāo)儀中速振蕩10 min至紫色結(jié)晶完全溶解，再于490 nm波長下檢測各孔吸光度（A），根據(jù)A值計算細胞存活率（%）。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

3 結(jié)果與分析

3.1 不同胰島素濃度及作用時間對HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

于無血清培養(yǎng)基中加入不同濃度胰島素，分別作用于HepG2細胞12，24，36，48，60，72 h，測定其葡萄糖消耗量，發(fā)現(xiàn)添加胰島素的模型組糖代謝出現(xiàn)異常（見圖1）。由圖1可見，葡萄糖消耗量與胰島素濃度呈一定的劑量反應(yīng)關(guān)系，胰島素作用12 h時，隨著胰島素濃度的上升，葡萄糖消耗量也隨之上升，胰島素濃度為5×10-6mol/L時葡萄糖消耗量達到最大，胰島素濃度繼續(xù)增大時葡萄糖消耗量降低。由24，36，48 h及60，72 h反應(yīng)曲線可見，葡萄糖消耗則分別在胰島素濃度為5×10-9，5×10-8或5×10-7mol/L時達到最大，隨胰島素濃度的上升，葡萄糖消耗量下降?？梢姡S著誘導(dǎo)時間的延長胰島素濃度升高反而會抑制細胞對葡萄糖的消耗，且作用時間越長發(fā)生趨勢改變所需的胰島素濃度越低。說明適當(dāng)升高誘導(dǎo)濃度可縮短誘導(dǎo)時間，或可通過延長誘導(dǎo)時間來降低誘導(dǎo)濃度。

圖1 不同胰島素濃度及作用時間對HepG2細胞消耗葡萄糖的影響

3.2 胰島素誘導(dǎo)后血清對HepG2 細胞葡萄糖消耗量的影響

HepG2細胞經(jīng)胰島素作用48 h，棄掉胰島素，加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，HepG2 細胞葡萄糖消耗量見圖2。由圖2a可見，隨胰島素濃度的升高，各時段葡萄糖消耗量均隨之增大，胰島素濃度為5×10-6mol/L時，葡萄糖消耗達最大。0～24 h葡萄糖的消耗量遠大于24～48 h及48～72 h，說明隨著時間的延長，細胞消耗葡萄糖的能力逐漸下降，但72 h內(nèi)趨勢相同。以5×10-5mol/L胰島素濃度作用48 h后，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h即可造成葡萄糖消耗量低于對照組。由圖2b可見，胰島素作用濃度為5×10-6mol/L時72 h累計葡萄糖消耗量達到最大值，之后則顯著下降。說明胰島素作用48 h后可誘導(dǎo)HepG2細胞在72 h內(nèi)保持穩(wěn)定的模型狀態(tài)。

圖2 胰島素誘導(dǎo)后HepG2細胞在無血清培養(yǎng)基中的葡萄糖消耗量

HepG2細胞經(jīng)胰島素作用48 h，棄掉胰島素，加入含10 %血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，HepG2 細胞葡萄糖消耗量見圖3。由圖3a可見，24 h時細胞葡萄糖消耗量隨胰島素濃度的增大而逐漸增大，胰島素濃度為5×10-6mol/L時，葡萄糖消耗達最大，與無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)時趨勢一致。24～48 h，葡萄糖消耗量隨胰島素濃度的升高呈先下降后升高趨勢，但各濃度下糖消耗量均低于對照組，且在胰島素濃度為5×10-9，5×10-8，5×10-5mol/L時差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），胰島素濃度為5×10-5mol/L時糖消耗量最低。48～72 h葡萄糖消耗趨勢與24～48 h相似，胰島素濃度為5×10-8mol/L時葡萄糖消耗量最低，其他濃度時差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可見隨培養(yǎng)時間的延長，不同濃度胰島素對細胞誘導(dǎo)的差異逐漸縮小。由圖3b可見，72 h葡萄糖累計消耗量也隨胰島素濃度的增大呈先降低后升高趨勢，說明細胞對葡萄糖消耗能力受培養(yǎng)時間影響很大，不同時間段可能呈現(xiàn)出不同趨勢，葡萄糖累計消耗情況也會隨之產(chǎn)生變化。與圖2相比可見，培養(yǎng)基中是否含血清對細胞誘導(dǎo)結(jié)果會產(chǎn)生不同的影響。以5×10-8mol/L胰島素濃度誘導(dǎo)48 h，在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，即可造成HepG2細胞葡萄糖消耗量穩(wěn)定低于對照組。

3.3 不同濃度胰島素誘導(dǎo)對HepG2細胞增殖的影響

HepG2細胞以不同濃度胰島素誘導(dǎo)后，均對其有促增殖作用，結(jié)果見表1。在未添加胰島素的對照組中，24 h時含血清組存活率為不含血清組的1.38倍，48 h，72 h時則分別為1.67倍和2.48倍，說明隨著培養(yǎng)時間的延長含血清培養(yǎng)基中HepG2細胞增殖更迅速。24 h時，胰島素濃度為5×10-9～5×10-6mol/L時，細胞增殖情況差異不大，胰島素濃度為5×10-5mol/L時細胞增殖受到抑制，這與無血清培養(yǎng)基中葡萄糖消耗趨勢相一致。48 h及72 h時，各組細胞存活率均隨胰島素濃度的升高而升高，且變化幅度較24 h時更顯著，即使在高濃度時也未見增殖抑制，說明細胞增殖情況與胰島素濃度呈正相關(guān)。含血清培養(yǎng)基中，72 h時各組細胞較48 h時對應(yīng)各組增殖顯著，說明細胞生長狀況良好。

表1 不同濃度胰島素誘導(dǎo)對HepG2細胞增殖的影響

3.4 不同濃度胰島素誘導(dǎo)對HepG2細胞葡萄糖比消耗率的影響

不同濃度胰島素作用不同時間后，培養(yǎng)基中無論是否添加血清，HepG2細胞葡萄糖比消耗率普遍低于對照組，見圖4、圖5。由圖4、圖5可見，試驗濃度范圍內(nèi)均可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生胰島素抵抗；24 h時葡萄糖比消耗率相近，可見培養(yǎng)基中是否添加血清對IR形成影響不大。48 h時，無血清培養(yǎng)基和含血清培養(yǎng)基中IR效果先增強后下降。72 h時葡萄糖比消耗率隨著胰島素濃度的升高呈連續(xù)下降趨勢，這也與之前得出的隨作用時間延長，發(fā)生胰島素抵抗所需胰島素濃度越來越低相吻合。在無血清和含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，葡萄糖比消耗率相對最低，即細胞普遍呈胰島素抵抗最明顯狀態(tài)。

圖4 無血清培養(yǎng)基中葡萄糖比消耗率

圖5 含血清培養(yǎng)基中葡萄糖比消耗率

4 討論與結(jié)論

國外從20世紀(jì)90年代初即開始這方面的研究，并已成功復(fù)制數(shù)種胰島素耐受細胞模型[21-22]，這些細胞模型主要有高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)、高葡萄糖培養(yǎng)、游離脂肪酸（FFA）誘導(dǎo)等模型，其中以高胰島素培養(yǎng)模型最為穩(wěn)定、可靠，使用也最為廣泛。

胰島素最主要的生物學(xué)作用是促進葡萄糖代謝。胰島素抵抗的最主要特征是機體對胰島素促進葡萄糖的攝取發(fā)生了抗性。既然低濃度胰島素會促進糖消耗，高濃度胰島素才會產(chǎn)生IR，那么建模所用胰島素濃度的確定對建立模型的可靠性意義重大。

文獻報道，誘導(dǎo)模型所用的胰島素濃度從5.8×10-3mg/ml[17]、30 μg/ml[8]、10 mg/L[18]、10-10mol/L[15]、5×10-7mol/L[14,23]至10-4mol/L[16]不等，誘導(dǎo)時間也從24 h至48 h不等。通過本試驗得出，誘導(dǎo)時間不同，出現(xiàn)胰島素抵抗的濃度也不同，誘導(dǎo)時間越長，所需胰島素濃度越低。HepG2細胞在胰島素中作用48 h后，換不含胰島素培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在無血清培養(yǎng)基中，低濃度時，葡萄糖消耗量隨胰島素濃度的升高呈增加趨勢，在5×10-5mol/L時受到抑制。在含血清培養(yǎng)基中，48～72 h培養(yǎng)階段，5×10-8mol/L濃度胰島素誘導(dǎo)的細胞模型葡萄糖消耗量最低。。

不同濃度胰島素在誘導(dǎo)后的72 h內(nèi)均會促進HepG2細胞增殖，且對葡萄糖消耗產(chǎn)生相應(yīng)的影響。通過計算比葡萄糖消耗率得出，在此試驗濃度范圍內(nèi)，葡萄糖比消耗率均低于對照組，即單位細胞葡萄糖消耗能力下降，形成了胰島素抵抗，葡萄糖總消耗量的升高是因為胰島素能促進HepG2細胞體外增殖造成的[24]，而并非單位細胞對葡萄糖消耗能力增強。在無血清培養(yǎng)基中，24 h時5×10-9mol/L誘導(dǎo)的細胞IR最明顯，48 h后則5×10-5mol/L誘導(dǎo)的IR最嚴(yán)重?？赡苁且驗樵贖epG2 細胞表面存在的胰島素受體在不同作用時間下受濃度的影響也不同。在含血清培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)后培養(yǎng)24 h時IR較強，其中5×10-9mol/L和5×10-8mol/L時IR最明顯。綜合考慮，選擇5×10-8mol/L胰島素誘導(dǎo)48 h后在含血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，且在5×10-9～5×10-5mol/L 濃度范圍內(nèi)效果穩(wěn)定。

因此，誘導(dǎo)HepG2細胞建立胰島素抵抗模型，要根據(jù)具體試驗時間，選擇合適的胰島素濃度及培養(yǎng)基，不可一概而論，建議以5×10-8mol/L濃度胰島素誘導(dǎo)48 h，換含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 h最易形成明顯的胰島素抵抗模型。此HepG2細胞模型在較長的時間內(nèi)（72 h）均可維持胰島素抵抗特性，可為篩選胰島素增敏劑提供充分的時間。