余澤恩，丁仕華，梁青青，劉 帆，李兆鵬，王衍成，郝若詩，黃業(yè)偉 *

(1. 普洱茶學教育部重點實驗室，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，云南 昆明 650201；3. 云南省高原特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)研究院，云南 昆明 650201；4.安康市林業(yè)局，陜西 安康 725000；5.安康市林業(yè)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心茶果站，陜西 安康 725000)

【研究意義】陜西安康屬于中國最北茶區(qū)[1]，“陜茶1號”作為陜西首個無性系茶樹新品種，具有發(fā)芽早、芽葉肥壯、節(jié)間長、持嫩性強、生長勢好、適應(yīng)性廣的特點。綠茶是中國六大茶類中知名度高、銷量較大的茶類之一，其內(nèi)含成分和保健功效亦有較多研究[2]。茶葉中的品質(zhì)成分主要包括多酚類物質(zhì)、生物堿類物質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)等。其中兒茶素是茶多酚的重要組成部分，咖啡因是茶葉中生物堿類物質(zhì)的代表，而茶葉中的主要氨基酸為茶氨酸，其次是谷氨酸[3]。茶葉沖泡條件和方法對茶葉中主要品質(zhì)成分的溶出具有較大影響，也影響茶湯的感官品質(zhì)和飲茶功效。決定茶葉鮮爽味的物質(zhì)主要是氨基酸，而咖啡因主要呈現(xiàn)苦味，兒茶素亦呈現(xiàn)苦澀味道?？Х纫颉翰杷睾桶被岬炔枞~中的主要生理活性成分[4-5]，它們具有不同的理化性質(zhì)，其水溶性差異較大。研究茶葉主要品質(zhì)成分的溶出規(guī)律，可根據(jù)消費者的身體條件和特殊需求(如部分消費者對咖啡因影響睡眠或者兒茶素會引起胃部不適等較為敏感)，有目的地控制主要品質(zhì)成分的溶出情況，為不同消費者提供具有針對性的茶葉沖泡條件和飲茶方式。【前人研究進展】有研究表明，在81 ℃、7 min、1 g/150 mL的條件下，茶多酚溶出量112.80 mg/g，其中，總兒茶素溶出量占總酚的57.29 %，得到的EGCG、ECG、EGC、EC和咖啡堿的溶出量均較高[6-8]。從綠茶溶出的微量元素角度分析，茶葉的最佳沖泡時間為10 min[9]。在對信陽毛尖茶的研究中顯示，根據(jù)茶葉的條索松緊，適宜沖泡條件為85 ℃、4 min或5 min、3 g/150 mL或4 g/150 mL，水浸出物、茶多酚、咖啡堿、氨基酸含量隨沖泡時間、沖泡溫度、茶水比的增大而增加[10]。沖泡方式直接影響著綠茶中咖啡因、兒茶素、氨基酸等主要品質(zhì)成分溶出量，進而影響到茶的湯色、香氣、滋味以及飲茶功效等[11-15]?！颈狙芯壳腥朦c】在眾多的研究中，對沖泡條件和品質(zhì)成分溶出率之間的關(guān)系給出了不同的說法，但并未根據(jù)人們的泡茶習慣提出針對特殊需求的沖泡條件和規(guī)律。該研究以綠茶“陜茶1號”為試樣，采用正交試驗設(shè)計和HPLC法探索沖泡條件對其主要品質(zhì)成分溶出的影響，找出與品質(zhì)成分溶出密切相關(guān)的關(guān)鍵因素，闡明其溶出規(guī)律?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為綠茶深加工產(chǎn)品開發(fā)、消費者科學飲茶以及茶藝理論的發(fā)展提供理論參考。

表1 正交試驗設(shè)計表

注：昆明地區(qū)水的沸點約為93.5 ℃。

Note:The boiling point of water in Kunming city was about 93.5 ℃.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶“陜茶1號”(一級，陜西安康漢水韻茶葉有限公司)；結(jié)晶乙酸鈉(分析純，天津市風船化學試劑科技有限公司)；乙腈[色譜純，默克化工技術(shù)(上海)有限公司]；甲醇(色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；磷酸(色譜純，北京邁瑞達科技有限公司)；L-谷氨酸、L-茶氨酸、咖啡因、EC、EGCG和ECG(≥98 %，阿拉丁)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀(安捷倫1260)；安捷倫熒光檢測器(G1321B 1260 FLD)；安捷倫紫外檢測器(G1314F 1260VWD)；Agilent ZORBAX Eclipse AAA-C18柱(5 μm，4.6 mm×150 mm，P.N. 993400-902)；低速離心機(中佳SC-3616)；移液器；0.45 μm過濾器；超聲波清洗機(上?？茖С晝x器有限公司SK-18TC)以及熱水器和溫度計等。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 以溫度(℃)、時間(min)、茶水比(g/mL)為3因素，根據(jù)人們?nèi)粘Ｅ莶?、飲茶的習慣(對于芽葉細嫩的綠茶，以水溫80～85 ℃、沖泡時間約5 min為宜)以及HPLC檢測的需要(茶水比在1∶100以內(nèi))，采用正交試驗設(shè)計(表1)，每個因素設(shè)置3個水平，每個處理重復3次。精密稱量2.00 g茶葉，分別按照不同的條件進行沖泡，收集茶湯，于4 ℃儲存，當天檢測。

表2 梯度洗脫程序

表3 進樣程序

1.3.2 氨基酸測定 流動相：A相為(90 mmol/L醋酸鈉，7 %乙腈，pH 6.5)，B相為80 %乙腈，梯度洗脫(表2)；流速1.0 mL/min；柱溫40 °C；進樣量為14 μl；25.5 min內(nèi)完成，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為230、450 nm，每1次完成后，系統(tǒng)平衡10 min后再次進樣[16]。

另外，HPLC測定茶葉中的氨基酸含量需要進行柱前衍生反應(yīng)，稱取10 mg OPA，用0.5 mL甲醇溶解后，加入30 μl β-巰基乙醇過濾，制成OPA衍生試劑，避光4 °C保存、備用。配制0.4 mol/L，pH 10.4硼酸鹽緩沖溶液。進樣程序見表3。

1.3.3 兒茶素及咖啡因測定 流動相A為5 %的乙腈(150 mL乙腈+9.21 mL磷酸+2842.17 mL UP水)；流動相B為80 %的乙腈(1200 mL乙腈+4.605 mL磷酸+296.085 mL UP水)；柱溫40 ℃；流速0.70 mL/min；進樣量為10.0 μl；VWD波長為280 nm，方法采用的梯度洗脫程序如表4所示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

表4 梯度洗脫程序

表5 主要品質(zhì)成分的含量

2 結(jié)果與分析

2.1 “陜茶1號”綠茶中主要品質(zhì)成分的含量

以綠茶“陜茶1號”為試樣，應(yīng)用HPLC法檢測了其主要品質(zhì)成分(咖啡因、主要兒茶素以及主要氨基酸)的含量。

由表5可知，綠茶“陜茶1號”咖啡因的含量為4 %左右；氨基酸含量較高，其中茶氨酸含量約為1.4 %，而谷氨酸含量約為0.2 %。此外，EGCG的含量高達11.75 %，ECG的含量為2.14 %，EC的含量達0.94 %。

2.2 沖泡條件對綠茶“陜茶1號”中咖啡因溶出的影響

咖啡因作為茶葉的主要品質(zhì)成分和功能成分，在茶葉口感和保健功效方面起著舉足輕重的作用。根據(jù)正交試驗設(shè)計，對綠茶在不同沖泡條件下的溶出率進行了檢測和分析。

由圖1可知，綠茶“陜茶1號”中咖啡因的溶出相對較慢，水溫為70 ℃、沖泡時間為2 min時咖啡因的溶出率僅為9.54 %。隨著沖泡時間的延長，咖啡因的溶出率才有明顯增加。水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時,“陜茶1號”咖啡因的溶出率達到36.83 %。

圖1 不同沖泡條件下綠茶“陜茶1號”中咖啡因的溶出率Fig.1 Dissolution rate of caffeine in green tea ‘Shanchayihao’ with different tea brewing condition

表6 咖啡因溶出率方差分析

圖2 不同沖泡條件下“陜茶1號”中酯型兒茶素的溶出率Fig.2 Dissolution rate of galloylated catechins in ‘Shanchayihao’ with different tea brewing condition

方差分析結(jié)果(表6)顯示，水溫、時間和茶水比3個因素對咖啡因溶出率的影響都極為顯著(P<0.01)，但其影響程度的大小有較大的差異。對綠茶中咖啡因溶出率影響的大小依次為時間>水溫>茶水比。

2.3 沖泡條件對綠茶“陜茶1號”中主要兒茶素溶出的影響

兒茶素可被分為酯型兒茶素和非酯型兒茶素兩類，酯型兒茶素是茶多酚的主要成分，約占茶葉中總兒茶素的3/4，是茶葉苦澀味的來源之一。酯型兒茶素對于茶葉品質(zhì)及功效的影響均高于非酯型兒茶素。

不同沖泡條件下酯型兒茶素的溶出情況如圖2所示，EGCG和ECG具有相似的溶出情況，水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時，EGCG溶出率為16.82 %，ECG的溶出率為12.38 %。方差分析結(jié)果(表7)顯示，水溫、時間和茶水比3個因素對EGCG溶出率的影響都極為顯著(P<0.01)，但其影響程度的大小有較大的差異。對EGCG溶出率影響的大小依次為時間>水溫>茶水比。與EGCG類似，時間和水溫對ECG溶出率的影響極為顯著(P<0.01)，且時間的影響程度較大。然而，茶水比對ECG的溶出率無顯著影響(P>0.05)。

表兒茶素(epicatechin，EC)是茶葉中含量較低的一種簡單兒茶素(非酯型兒茶素)，其溶出規(guī)律與酯型兒茶素亦不相同，圖3和表7。

由圖3可知，隨著水溫的升高、時間的延長其溶出率明顯提高。水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時EC的溶出率達34.56 %。方差分析結(jié)果顯示，水溫和時間對EC溶出率的影響都極為顯著(P<0.01)，茶水比對EC溶出率的影響顯著(P<0.05)。影響的大小依次為水溫>時間>茶水比。

2.4 沖泡條件對綠茶“陜茶1號”中主要氨基酸溶出的影響

氨基酸是茶葉鮮味的主要物質(zhì)，是茶葉香氣和滋味等品質(zhì)的重要成分，其中茶氨酸和谷氨酸是較重要且含量較高的主要游離氨基酸。不同沖泡條件下主要氨基酸的溶出情況。

圖3 不同沖泡條件下“陜茶1號”表兒茶素的溶出率Fig.3 Dissolution rate of epicatechin in ‘Shanchayihao’ with different tea brewing condition

表7 溶出率方差分析

表8 溶出率方差分析

由圖4可知，在不同的沖泡條件下，“陜茶1號”中茶氨酸和谷氨酸的溶出率相近。水溫為70 ℃、沖泡時間為2 min時，“陜茶1號”氨基酸的溶出率即達25 %左右，比咖啡因的溶出更快。水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時，“陜茶1號”中氨基酸的溶出率可達76 %左右。

圖4 不同沖泡條件下綠茶“陜茶1號”茶氨酸和谷氨酸的溶出率Fig.4 Dissolution rate of amino acid in green tea ‘Shanchayihao’ with different tea brewing condition

圖5 主要品質(zhì)成分溶出率的比較Fig.5 Comparison of the main quality components dissolution rate

方差分析結(jié)果(表8)顯示，水溫、時間和茶水比3個因素對氨基酸溶出率的影響都極為顯著(P<0.01)，但其影響程度的大小有較大的差異，依次為時間>水溫>茶水比。

2.5 綠茶“陜茶1號”中主要品質(zhì)成分溶出率的比較

為了更好地了解綠茶“陜茶1號”中主要品質(zhì)成分之間溶出規(guī)律的差異，根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，分析比較了主要品質(zhì)成分的溶出率。

由圖5可知，2種沖泡條件下各品質(zhì)成分的溶出率差異較大。水溫為70 ℃、時間為2 min時，茶氨酸和谷氨酸的溶出率即超過20 %，咖啡因的溶出率接近10 %，而酯型兒茶素的溶出率很低(不到2 %)。水溫為93.5 ℃、時間為10 min時，茶氨酸和谷氨酸的溶出率超過3/4，咖啡因與EC的溶出率相當(35 %左右)，酯型兒茶素的溶出率仍較低，溶出約1/6。相同條件下不同品質(zhì)成分溶出速率的順序為氨基酸>咖啡因>非酯型兒茶素>酯型兒茶素。

3 討 論

影響茶品質(zhì)成分溶出的因素有很多，茶品種、茶葉形狀、整碎度、沖泡時間、沖泡溫度、茶水比等[5-15]。中國飲茶習慣中還是以沖泡飲用為主。隨著生活水平的不斷提高，茶葉消費人群亦逐漸擴展。消費者在飲茶工程中遇到的問題也逐漸凸顯，如飲茶影響睡眠、飲茶傷胃、飲茶導致血糖偏低等問題越發(fā)常見。引起以上問題的主要原因就是飲茶過程中攝取的茶葉內(nèi)含成分的種類及其總量。此外，隨著茶葉功效的研究力度加大、研究成果發(fā)表的增多，也使茶葉保健功效得到廣大消費者的認可。然而，消費者卻很少知道如何科學飲茶才能達到自己期望的效果。這些都與茶葉的沖泡條件息息相關(guān)。

咖啡因作為茶葉的主要品質(zhì)成分和功效組分，是茶葉苦味的來源之一，具有降血糖，興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和心臟，舒張血管等生理作用。實驗結(jié)果表明，時間是影響綠茶“陜茶1號”咖啡因溶出的最大原因。綠茶中咖啡因的溶出相對較慢，水溫為70 ℃、沖泡時間為2 min時咖啡因的溶出率僅為9.54 %。隨著沖泡時間的延長，咖啡因的溶出率才有明顯增加。水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時，綠茶中咖啡因的溶出率達到36.83 %。方差分析結(jié)果亦顯示，時間是影響咖啡因溶出的最主要因素，這可能咖啡因脂溶性較強(咖啡因在氯仿層和水層的分配比例約為15∶1)有關(guān)[17-18]。因此，在茶葉沖泡時，如果不想攝入太多的咖啡因(如具有咖啡因引起的失眠或低血糖癥狀者)，喝綠茶時可以盡量縮短茶葉沖泡時間或只喝第一至二泡。

兒茶素是茶葉的主要品質(zhì)成分和功效組分，是綠茶苦澀味的主要來源，具有抗氧化、防輻射、抗炎、調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善腸道功能等生理作用[19-21]。實驗結(jié)果顯示，2種酯型兒茶素(EGCG和ECG)的溶出均相對較慢。水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時，酯型兒茶素的溶出率僅為1/6左右。與咖啡因相比，酯型兒茶素更難溶于水中，這些結(jié)果在一定程度上解釋了茶葉比較耐泡的原因。由于EC在茶葉中的含量較低，其溶出率卻顯著高于酯型兒茶素。水溫為93.5 ℃、沖泡時間為10 min時，EC的溶出率可達1/3左右。因此，若想發(fā)揮EGCG等酯型兒茶素的抗氧化、防輻射等功效，需要較高的水溫和較長的沖泡時間。

L-茶氨酸也是茶葉中重要的功能成分之一，占茶葉干物質(zhì)總重的1 %～2 %，具有保護神經(jīng)、緩解壓力、改善睡眠和抗焦慮等多種功效[22-24]。且谷氨酸和乙胺在茶氨酸合成酶的催化下可轉(zhuǎn)化為茶氨酸。由于茶氨酸和谷氨酸具有相似的溶解性，其溶解趨勢基本一致。影響綠茶中氨基酸溶解的最主要因素都是沖泡時間。與咖啡因和兒茶素不同，在同一沖泡條件下氨基酸的溶出率明顯較高，說明茶氨酸和谷氨酸更易溶出。因此，在茶葉沖泡時，如果想攝入較多的氨基酸而少攝入咖啡因，以達到保護神經(jīng)、緩解壓力、改善睡眠和抗焦慮等功效，在沖泡時可以盡量縮短茶葉沖泡時間，增加茶氨酸與咖啡因的溶出比，發(fā)揮茶氨酸的功效而避免咖啡因的副作用。

此外，茶水比(1∶25～1∶100)對綠茶中主要品質(zhì)成分溶出的影響相對較小，這可能是因為在此茶水比范圍內(nèi)，這些成分的溶出遠未達到飽和狀態(tài)?？傊?，闡明茶葉中品質(zhì)成分的溶出規(guī)律，可為茶深加工產(chǎn)品開發(fā)、消費者科學飲茶以及茶藝理論的發(fā)展提供參考。

4 結(jié) 論

“陜茶1號”相同條件下不同品質(zhì)成分溶出速率的順序為：氨基酸>咖啡因>非酯型兒茶素>酯型兒茶素，對咖啡因、酯型兒茶素和主要氨基酸溶出率的影響因素排序為：時間>水溫>茶水比，對EC溶出率影響的大小依次為：水溫>時間>茶水比。