鐘楊生，陳恒文，陳芳艷，林健榮

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

桑葉為?？浦参锷洌∕orus albaL.）的葉子。據(jù)《神農(nóng)本草》記載，桑葉味苦、甘，能夠疏散風(fēng)熱、清肝明目、清肺潤燥，具有降血糖、降血脂、抗衰老等作用。通過近代藥理學(xué)的研究和分析發(fā)現(xiàn)桑葉中的功效成分有黃酮、多糖、生物堿等活性物質(zhì)［1-3］。本課題組在開展桑葉活性物質(zhì)的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗青10號(hào)、云陽、大紅皮等品種的桑葉富含γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA)，尤其在桑嫩芽中含量更高［4-6］。GABA是哺乳動(dòng)物神經(jīng)中樞的一種抑制性遞質(zhì)，具有調(diào)節(jié)血壓、促使精神安定、促進(jìn)腦部血流、增進(jìn)腦活力、營養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞、增加生長激素分泌、健肝利腎、促進(jìn)乙醇代謝（醒酒）等多種功效［7-10］。2009年衛(wèi)生部已正式批準(zhǔn)GABA為新資源食品，隨著人們對GABA研究的不斷深入，GABA作為新型功能因子逐漸被運(yùn)用于食品、飼料、醫(yī)藥及化妝品等領(lǐng)域［11-12］。桑樹在我國種植范圍廣、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、資源豐富，對桑葉GABA進(jìn)行研究并加以開發(fā)利用，具有重要的科學(xué)價(jià)值和廣闊的市場前景。

依據(jù)GABA水溶性的特點(diǎn)，通常以水為溶劑提取，但傳統(tǒng)的提取方法提取時(shí)間長、提取效率低［15］。微波輔助萃取法相對于傳統(tǒng)方法可縮短提取時(shí)間、提高提取效率、降低能耗［16-18］。超聲-微波協(xié)同萃取技術(shù)則是將超聲波和微波結(jié)合在一起的新技術(shù)。超聲波利用在溶劑和樣品間產(chǎn)生的聲波空化作用，可增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物溶出速度和溶出量。微波的電場能夠引起分子運(yùn)動(dòng)，極性分子在微波電磁場的作用下，產(chǎn)生瞬間極化，從而產(chǎn)生鍵的振動(dòng)、撕裂和粒子之間的相互摩擦、碰撞，使分子極性部分更好地接觸和反應(yīng)，同時(shí)迅速生成大量熱能。物質(zhì)吸收微波能，細(xì)胞內(nèi)部溫度迅速上升，壓力超過細(xì)胞壁膨脹承受能力，使細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分自由流出，從而有利于細(xì)胞中物質(zhì)的提?。?9-22］。鐘楊生等［15-16］報(bào)道了用傳統(tǒng)提取法和微波輔助萃取法萃取桑葉GABA的工藝，但目前尚未見用超聲-微波協(xié)同萃取法提取桑葉GABA 的報(bào)道。本文采用超聲-微波協(xié)同萃取法提取桑葉GABA，可為下一步開展桑葉GABA活性功能研究打下基礎(chǔ)，為桑葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗青10號(hào)桑葉由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供。桑葉經(jīng)水洗后60℃干燥粉碎過630 μm篩，用甲醇去色素后干燥，置于4℃條件下冷藏備用；γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品購自美國Sigma公司；次氯酸鈉、重蒸酚、氫氧化鉀、無水乙醇、三氯化鑭、碳酸鈉、碳酸氫鈉等均為分析純試劑。

CW-2000型超聲-微波協(xié)同萃取儀為上海新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司產(chǎn)品，微波功率10～800 W，微波頻率2 450 MHz，超聲波功率50 W，超聲波頻率40 KHz；UV-1700紫外分光光度計(jì)為日本島津儀器（蘇州）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GABA含量測定 參照文獻(xiàn)［4，23］的方法進(jìn)行不同濃度GABA標(biāo)準(zhǔn)液配制，在645 nm波長下測定吸光值，根據(jù)測得的吸光值以及相對應(yīng)的GABA含量制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法得到回歸方程y=0.6827x+0.0249（R2=0.9923），表明 GABA濃度與吸光度具有良好的線性關(guān)系。取適量樣品提取液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品每克干桑葉中GABA的含量。

1.2.2 料液比對GABA提取量的影響 準(zhǔn)確稱取2 g桑葉6份，分別按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g∶mL)加入蒸餾水，在微波功率100 W、超聲波功率50 W的條件下提取2 min，提取次數(shù)為1次，測定GABA含量。

1.2.3 微波功率對GABA提取量的影響 準(zhǔn)確稱取2 g桑葉8份，固定料液比1∶20，提取2 min，提取1次，超聲波功率50 W(超聲波功率固定，不可調(diào))，調(diào)節(jié)微波功率為50、100、150、200、250、300、350、400 W，測定GABA含量。

1.2.4 提取時(shí)間對GABA提取量的影響 準(zhǔn)確稱取2 g桑葉6份，固定微波功率100 W、超聲波功率50 W、料液比1∶20加水，提取1次，分別提取1、2、3、4、5、6 min，測定GABA含量。

1.2.5 提取次數(shù)對GABA提取量的影響 準(zhǔn)確稱取2 g桑葉3份，固定微波功率100 W，超聲波功率50 W、料液比1∶20加水、提取2 min，分別提取1、2、3次，測定GABA含量。

1.2.6 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，每個(gè)因素選取3個(gè)對GABA提取量影響較大的水平，建立3因素3水平的Box-Behnken中心試驗(yàn)，以GABA提取量為響應(yīng)值，各因素3水平采用-1、0、1進(jìn)行編碼（表1）。

表1 Box-Behnke試驗(yàn)水平和編碼

采用Design-Expert V8.0.6 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對GABA提取效果的影響

2.1.1 料液比對桑葉GABA提取量的影響 從圖1可以看出，GABA提取量隨著料液比的增加而增加，當(dāng)料液比增大到1∶40時(shí)，繼續(xù)增大料液比提取率變化不大。從提取效率以及產(chǎn)品后加工的濃縮處理工序考慮，選擇最適宜的料液比為1∶40。

圖1 料液比對桑葉GABA提取量的影響

2.1.2 微波功率對桑葉GABA提取量的影響 在料液比為1∶40條件下，研究微波功率對提取效率的影響，結(jié)果見圖2。GABA的提取量隨著微波功率的增大而增加，在150 W時(shí)提取量達(dá)最大值，之后GABA提取量隨著微波功率增加反而略有降低。可能是由于在低功率時(shí)分子運(yùn)動(dòng)不劇烈，破細(xì)胞效果不明顯，故GABA浸出率不高；隨著微波功率的不斷增加，分子運(yùn)動(dòng)加劇，有利于GABA的溶出；而當(dāng)微波功率進(jìn)一步加強(qiáng)時(shí)，其強(qiáng)熱效應(yīng)可對GABA產(chǎn)生破壞而減少，造成提取率下降；另外微波功率過高容易產(chǎn)生爆沸現(xiàn)象。因此，選擇150 W為最佳提取功率。

圖2 微波功率對桑葉GABA提取量的影響

2.1.3 提取時(shí)間對桑葉GABA提取量的影響 由圖3可知，提取時(shí)間在3 min時(shí)GABA提取量最大，之后隨著提取時(shí)間延長，其提取效率增加并不明顯?？赡芤?yàn)槌?、微波處理能使?xì)胞在短時(shí)間內(nèi)迅速破裂，GABA快速溶出，使溶質(zhì)迅速達(dá)到固液平衡，因此延長時(shí)間效果不理想。因此，選擇最佳微波處理時(shí)間為3 min。

圖3 提取時(shí)間對桑葉GABA提取量的影響

2.1.4 提取次數(shù)對桑葉GABA提取量的影響在上述最佳提取條件下，考察提取次數(shù)對桑葉GABA提取量的影響。連續(xù)提取3次，第1次提取量是總提取量的91%、第2次為5%、第3次為4%。盡管總提取量隨著提取次數(shù)的增加而增加，但是第2次和第3次增加的幅度都很小，因此，選擇提取1次。如果有連續(xù)提取設(shè)備，可采用逆流提取提高效率。

2.2 超聲-微波協(xié)同萃取法的Box-Behnken試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響桑葉GABA提取量最為密切的料液比、微波功率和提取時(shí)間這3個(gè)因子進(jìn)行Box-Behnken組合設(shè)計(jì)，結(jié)果見表2。根據(jù)表2結(jié)果計(jì)算各項(xiàng)回歸系數(shù)，以這些回歸系數(shù)建立桑葉GABA提取量與料液比（X1）、微波功率（X2）和提取時(shí)間（X3）3個(gè)因子的回歸方程：

方差分析顯著性檢驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，該模型與試驗(yàn)擬合較好，回歸方程R2=0.9916，自變量與響應(yīng)值線性關(guān)系顯著，可以用于桑葉GABA超聲-微波輔助提取試驗(yàn)的理論預(yù)測。在P=0.05顯著水平剔除不顯著項(xiàng)，得到優(yōu)化方程為：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可以看出，微波功率（X2）與提取時(shí)間（X3）的互作效應(yīng)對桑葉GABA提取量影響明顯，從響應(yīng)面圖（圖4）可知，在所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)條件范圍內(nèi)，微波功率和提取時(shí)間都可增加桑葉GABA提取率，二者交互作用表現(xiàn)為桑葉GABA提取量增大。

采用貢獻(xiàn)率法對各因素的重要性分析可知，料液比、微波功率和提取時(shí)間對提取率的貢獻(xiàn)率分別為2.4158、2.3669和2.4365，對桑葉GABA提取量作用大小依次為提取時(shí)間＞料液比＞微波功率。微波處理時(shí)間長短對提取量的影響最大，可能是因?yàn)槲⒉ù┩改芰O強(qiáng)，直接作用于桑葉細(xì)胞內(nèi)部，使有效成分很快溶出，同時(shí)可使溶劑溫度升高較快，有利于有效成分的提取。

表3 回歸模型及方差分析

圖4 微波功率和提取時(shí)間對GABA提取量的交互作用

通過SAS響應(yīng)面分析，并結(jié)合數(shù)學(xué)模型，超聲-微波協(xié)同提取桑葉GABA的最優(yōu)參數(shù)為：料液比1∶34，微波功率為144 W，提取時(shí)間為165 s。在此工藝條件下桑葉GABA提取的理論值為5.77 mg/g。采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行GABA提取，結(jié)果實(shí)際得到桑葉GABA的提取量為5.83 mg/g，與理論值相比相對誤差很小。

3 結(jié)語

本試驗(yàn)選用超聲-微波協(xié)同萃取法提取桑葉GABA，以蒸餾水為溶劑，研究超聲波-微波的功率、料液比及提取時(shí)間對提取率的影響。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Behnken旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，確定了最適的提取工藝，并按最佳工藝進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)，優(yōu)選出超聲-微波協(xié)同提取桑葉GABA的最優(yōu)參數(shù)為：料液比1∶34，超聲波功率為50 W，微波功率為144 W，處理時(shí)間為165 s，提取1次。在此工藝條件下提取量為5.83 g/mg。各影響因素貢獻(xiàn)率表現(xiàn)為提取時(shí)間＞料液比＞微波功率。

采用超聲-微波協(xié)同萃取法提取桑葉γ-氨基丁酸（GABA）提取率高、提取時(shí)間短，抗青10號(hào)的桑葉GABA提取量為5.83 mg/g，提取時(shí)間為165 s；傳統(tǒng)水提取法提取桑葉GABA,提取時(shí)間為 2.13 h，在同一品種同一測定方法條件下桑葉GABA提取量為 4.64 mg/g［15］；而微波輔助萃取法處理時(shí)間為 11.69 min，提取量為5.83 mg/g［16］。可見，采用超聲-微波萃取法可顯著提高生產(chǎn)效率。