明 磊，戴習(xí)林*，江宗冰，丁福江

(1.上海海洋大學(xué)/農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司，上海 201516)

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)(Arthropoda)、甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decaplda)、游泳亞目(Natqntin)、長(zhǎng)臂蝦科(Palaemonidae)、沼蝦屬(Macrobrachium)，自然分布于東南亞各國(guó)，印度、斯里蘭卡、泰國(guó)、馬來(lái)西亞、柬埔寨、越南、菲律賓等國(guó)的淡水、半咸水環(huán)境中均有分布，被不少國(guó)家和地區(qū)移養(yǎng)繁殖，成為移養(yǎng)地的主要淡水養(yǎng)殖品種[1]。近年來(lái)，由于養(yǎng)殖模式集約化以及養(yǎng)殖水環(huán)境惡化等問(wèn)題，羅氏沼蝦病害日趨嚴(yán)重，其中由弧菌引起的細(xì)菌性疾病可發(fā)生于羅氏沼蝦的親蝦培育和育苗階段，臨床表現(xiàn)為肌肉白濁、紅體等，病蝦常浮于水面，給羅氏沼蝦的苗種業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害。

溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae)、弧菌屬(Vibrio)，為革蘭氏陰性短桿菌[2]，廣泛分布于世界各地海水及河口區(qū)[3]，數(shù)量在海水類弧菌中居于首位[4]，對(duì)魚(yú)、蝦、蟹等水產(chǎn)動(dòng)物均具有較強(qiáng)的致病性。為了提高羅氏沼蝦的抗病性能，筆者所在實(shí)驗(yàn)室自2011年通過(guò)自然選擇和人工感染溶藻弧菌開(kāi)展了羅氏沼蝦的抗病選育工作。為了進(jìn)一步了解羅氏沼蝦抗病子3代群體的抗病性能，本研究通過(guò)對(duì)羅氏沼蝦進(jìn)行溶藻弧菌肌肉注射感染，借助高通量測(cè)序首先分析了注射溶藻弧菌后羅氏沼蝦體內(nèi)菌群的變化，然后對(duì)感染成活率最高和最低的抗病選育群體以及非選育群體的養(yǎng)殖池水及腸道組織進(jìn)行菌群多樣性分析，以期為羅氏沼蝦的免疫機(jī)制研究以及進(jìn)一步選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)親蝦的基礎(chǔ)群體來(lái)源于上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司的人工養(yǎng)殖繁殖群體(已連續(xù) 15 a閉鎖選育)，采取肌肉注射方法感染溶藻弧菌，存活的健康羅氏沼蝦群體作為抗病專門(mén)化品系選擇系的基礎(chǔ)群體[5]。試驗(yàn)用蝦是經(jīng)人工選擇配對(duì)和育苗并自然交尾建立的4個(gè)羅氏沼蝦抗病專門(mén)化品系中選擇系子3代群體(A、B、C、D)和1個(gè)上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司繁育養(yǎng)殖的非選育群體(E)。5個(gè)群體試驗(yàn)用蝦規(guī)格一致，體長(zhǎng)(8.25±0.73)cm，體質(zhì)量(16.76±4.76)g，于水泥池(8 m×3 m×1.2 m)中養(yǎng)殖。試驗(yàn)用溶藻弧菌為從上海申漕特種水產(chǎn)開(kāi)發(fā)公司的羅氏沼蝦親蝦培育池養(yǎng)殖水體中分離，經(jīng)鑒定傳代保種的溶藻弧菌菌種，對(duì)羅氏沼蝦具有很強(qiáng)致病性[5]。試驗(yàn)用水為24 h曝氣后經(jīng)檢測(cè)無(wú)余氯殘留的自來(lái)水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液的制備 將菌種在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中活化，然后在TCBS固體培養(yǎng)基中進(jìn)行劃線分離，37 ℃培養(yǎng)24 h；挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于28 ℃、200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱富集培養(yǎng)18 h；收集菌液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min后棄上清液，無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀2次后按要求稀釋成1×108cfu/mL(采用平板活菌計(jì)數(shù)法)的菌懸液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 注射感染試驗(yàn)及肌肉組織的取樣 做試驗(yàn)前將試驗(yàn)水槽(70 cm×50 cm×40 cm)沖洗干凈，用5‰高錳酸鉀水溶液浸泡30～60 min進(jìn)行消毒，最后用自來(lái)水沖洗干凈。向水槽中注入占水槽體積2/3的自來(lái)水，充分曝氣24 h后放蝦。

對(duì)4個(gè)抗病選育群體(A、B、C、D)和1個(gè)非選育群體(E)進(jìn)行弧菌注射感染試驗(yàn)，各羅氏沼蝦群體的對(duì)照組(a、b、c、d、e)注射生理鹽水，每個(gè)試驗(yàn)組均設(shè)2個(gè)平行。感染方法為肌肉注射法，在第二、三腹節(jié)間注射1×108cfu/mL的溶藻弧菌懸液(此劑量經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定)，注射劑量為3×106cfu/g。

每個(gè)平行組感染20只蝦(1 min內(nèi)感染完成)，分別在感染后5、30、60、90、120 min取樣，每個(gè)平行組在不同取樣時(shí)間點(diǎn)各隨機(jī)選取1只存活的羅氏沼蝦，于無(wú)菌條件下取感染部位(第二、三腹節(jié)間)的肌肉放入滅菌離心管中(同一試驗(yàn)組的2個(gè)平行肌肉樣品放1個(gè)離心管)，標(biāo)記后-80 ℃冷凍保存。樣品編號(hào)：A群體感染組編號(hào)依次為A1、A2、A3、A4、A5，其生理鹽水對(duì)照組為a1、a2、a3、a4、a5；以此類推，共50個(gè)樣品。

取完蝦樣后，每個(gè)平行組感染30只蝦用來(lái)統(tǒng)計(jì)不同群體的感染成活率，試驗(yàn)周期為15 d，每天定時(shí)統(tǒng)計(jì)各組的死亡只數(shù)。試驗(yàn)蝦的日常管理工作參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行。

1.2.3 羅氏沼蝦腸道和養(yǎng)殖水環(huán)境的取樣 對(duì)感染成活率最低、最高的羅氏沼蝦抗病選育群體以及非抗病選育群體進(jìn)行取樣，取樣樣品包括羅氏沼蝦的水泥池(8 m×3 m×1.2 m)養(yǎng)殖水體及腸道組織。養(yǎng)殖水體樣品的編號(hào)依次為F、G、H，腸道組織的編號(hào)分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。取樣方法為每個(gè)養(yǎng)殖水泥池的四角和中間分別取500 mL水體，混合后用0.22 μm孔徑的無(wú)菌纖維素濾膜進(jìn)行抽濾，無(wú)菌濾膜-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)每個(gè)池挑選規(guī)格一致的10只蝦(每個(gè)取樣點(diǎn)2只)，于冰上無(wú)菌操作獲取腸道組織，將10只蝦的腸道混合成一個(gè)樣品。

1.2.4 高通量測(cè)序 用 OMEGA 公司的 Soil DNA試劑盒提取羅氏沼蝦組織樣本和養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。PCR擴(kuò)增的引物序列為338F：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR擴(kuò)增采用20 μL反應(yīng)體系：5×Fast Pfu Buffer 4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，引物(5 μmol/L)各0.8 μL，BSA 0.2 μL，F(xiàn)ast Pfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，補(bǔ) ddH2O 至20 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性180 s；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，28 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。使用上海美吉生物公司16s-338F-806R MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序數(shù)據(jù)的分析

1.2.5.1 數(shù)據(jù)分析流程 數(shù)據(jù)分析流程主要包括：數(shù)據(jù)處理→聚類(Operational taxonomic unit，OTU)→分類學(xué)分析。其具體分析方法為：使用Trimmomatic和FLASH軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化和統(tǒng)計(jì)；采用Usearch(Version 7.1，http://drive5.com/uparse/)軟件平臺(tái)進(jìn)行OTU聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并分別在各個(gè)分類水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成；計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)(Chao、Ace、Shannon、Simpson)，估計(jì)環(huán)境群落的物種豐度和多樣性；使用97%相似度的OTU，利用mothur進(jìn)行稀釋性分析，利用R語(yǔ)言工具制作稀釋性曲線圖；使用97%相似度的OTU，利用mothur計(jì)算不同隨機(jī)抽樣下的多樣性指數(shù)Shannon值，利用R語(yǔ)言工具制作曲線圖；OTU分布Venn圖利用R語(yǔ)言工具統(tǒng)計(jì)并作圖；利用R語(yǔ)言進(jìn)行主成分分析(PCA)并作圖；利用R語(yǔ)言或Excel制作群落結(jié)構(gòu)組分圖。

1.2.5.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析指數(shù)(Chao、Ace、Shannon、Simpson)的計(jì)算公式 Chao：用Chao1算法估計(jì)樣本中所含OTU數(shù)目的指數(shù)，Chao1在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)估計(jì)物種總數(shù)。計(jì)算公式如下：

式中，SChao1=估計(jì)的OTU數(shù)；Sobs=實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)；n1=只含有1條序列的OTU數(shù)目(如“singletons”)；n2=只含有2條序列的OTU數(shù)目(如“doubletons”)。

Ace：用來(lái)估計(jì)群落中OTU數(shù)目的指數(shù)，是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)之一，與Chao1的算法不同。計(jì)算公式如下：

式中，ni=含有i條序列的OTU數(shù)目；Srare=含有“abund”條序列或者少于“abund”的OTU數(shù)目；Sabund=多于“abund”條序列的OTU數(shù)目；abund=“優(yōu)勢(shì)”O(jiān)TU的閾值，默認(rèn)為“10”。

Simpson：用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一，在生態(tài)學(xué)中常用來(lái)定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性。Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。

式中，Sobs=實(shí)際觀測(cè)到的OTU數(shù)目；ni=第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N=所有的序列數(shù)。

Shannon：用來(lái)估算樣本中微生物多樣性的指數(shù)之一。它與Simpson多樣性指數(shù)常用于反映alpha多樣性指數(shù)。Shannon值越大，說(shuō)明群落多樣性越高。

式中，Sobs=實(shí)際測(cè)量出的OTU數(shù)目；ni=第i個(gè)OTU所含的序列數(shù)；N=所有的序列數(shù)。

Coverage ：是指各樣本文庫(kù)的覆蓋率，其數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高，而沒(méi)有被測(cè)出的概率越低。該指數(shù)反映本次測(cè)序結(jié)果是否代表了樣本中微生物的真實(shí)情況。

式中，n1=只含有1條序列的OTU數(shù)目；N=抽樣中出現(xiàn)的總序列數(shù)目。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于16S rRNA 基因測(cè)序的細(xì)菌多樣性

由圖1和圖2可知，56個(gè)樣品(50個(gè)肌肉組織、3個(gè)水樣和3個(gè)腸道組織)曲線逐漸趨向平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，有效測(cè)序數(shù)量已經(jīng)能夠很好地覆蓋測(cè)序樣品的菌群組成。由表1可知，A群體感染組的Ace指數(shù)最高，E群體對(duì)照組的Ace最低；C群體感染組的Shannon多樣性指數(shù)(3.30)最高，Simpson指數(shù)最低(0.080 0)；D群體對(duì)照組的Shannon多樣性指數(shù)(2.54)最低，Simpson指數(shù)最高(0.243 1)。觀察發(fā)現(xiàn)，各群體感染組的Simpson指數(shù)均低于對(duì)照組，說(shuō)明感染溶藻弧菌會(huì)導(dǎo)致羅氏沼蝦組織的菌群多樣性升高。由表2可知，水樣F的Simpson指數(shù)最低(0.094)，菌群多樣性最高；水樣H的Simpson指數(shù)最高(0.131)，菌群多樣性最低。腸道組織樣品Ⅰ的Simpson指數(shù)最高(0.321)，菌群多樣性最低；腸道組織樣品Ⅲ的Simpson指數(shù)最低(0.087)，菌群多樣性最高。

2.2 基于弧菌含量的抗病力分析

由表3可知，4個(gè)羅氏沼蝦抗病選育群體的注射生理鹽水對(duì)照組均未檢測(cè)出弧菌，而非選育群體的對(duì)照組于60 min檢測(cè)出0.008 13%的弧菌，表明羅氏沼蝦的抗病選育取得了一定效果。注射感染組中，A群體的蝦5個(gè)時(shí)間段中體內(nèi)弧菌含量都為0，表明A群體有較強(qiáng)的抗弧菌感染能力，選育效果明顯；C群體的蝦體內(nèi)平均弧菌含量高達(dá)2.718 40%，抗弧菌感染能力在5個(gè)群體中最低，選育效果不明顯；B群體的蝦體內(nèi)平均弧菌含量為0.002 83%，抗弧菌感染能力僅次于A群體；D、E群體的體內(nèi)平均弧菌含量相差不大。根據(jù)5個(gè)時(shí)間段中不同群體蝦肌肉組織的平均弧菌含量，得到5個(gè)群體的抗弧菌感染能力為A>B>E>D>C。

圖1 羅氏沼蝦肌肉組織樣品高通量測(cè)序結(jié)果的稀釋性曲線

圖2 羅氏沼蝦養(yǎng)殖水體及腸道組織高通量測(cè)序結(jié)果的稀釋性曲線

組別OTUAceCoverageShannonSimpsonA485.4±210.78572.2±264.660.996 1±0.003 13.19±0.230.107 2±0.026 8a412.6±53.68 474.4±60.38 0.997 4±0.001 33.26±0.630.126 9±0.067 2B287.6±120.96324.4±130.590.998 5±0.000 63.09±0.310.092 4±0.008 0b389.8±115.77490.2±92.74 0.997 7±0.000 42.91±0.380.174 5±0.046 2C367.6±115.01427.0±131.850.997 5±0.001 43.30±0.400.080 0±0.022 4c292.0±34.57 339.4±34.04 0.997 5±0.002 32.83±0.190.167 4±0.034 1D390.0±272.53448.6±299.490.997 9±0.001 23.08±0.520.110 7±0.021 3d339.0±145.80406.0±146.700.997 1±0.001 42.54±0.930.243 1±0.203 9E345.4±211.40435.8±230.350.996 8±0.002 73.06±0.590.100 2±0.014 7e268.4±69.81 299.8±93.91 0.998 4±0.001 12.67±0.090.190 0±0.025 4

表2 基于16S rRNA基因序列的羅氏沼蝦腸道組織和養(yǎng)殖水環(huán)境細(xì)菌多樣性指數(shù)

表3 注射感染后不同時(shí)間段抗病選育群體與非選育群體羅氏沼蝦體內(nèi)的弧菌含量 %

2.3 羅氏沼蝦抗病選育與非選育群體的感染成活率比較

本研究對(duì)4個(gè)羅氏沼蝦抗病選育群體和非選育群體進(jìn)行人工注射溶藻弧菌感染，測(cè)試不同選育群體之間的抗弧菌感染能力差異。感染15 d后統(tǒng)計(jì)2個(gè)平行組的平均成活率，結(jié)果表明，不同群體間的抗病能力存在一定差異(圖3)。其中A群體的平均感染成活率最高，為83.33%，C群體的平均感染成活率最低，為58.33%，B、D、E群體的平均感染成活率分別為66.67%、61.67%、63.33%。A群體的抗病能力與C群體差異顯著(P<0.05)，B、C、D、E群體間差異均不顯著。

不同小寫(xiě)字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

2.4 羅氏沼蝦抗病選育與非選育群體感染組和對(duì)照組肌肉組織樣品微生物菌群分析

如表4所示，感染組和對(duì)照組的羅氏沼蝦樣品中微生物主要分為6個(gè)門(mén)，分別是厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、軟壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)。各組樣品中厚壁菌門(mén)都占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，C群體對(duì)照組最高為71.63%；次優(yōu)勢(shì)類群為變形菌門(mén)，含量最高的為D群體對(duì)照組的41.90%，含量最低的為C群體對(duì)照組的21.08%；軟壁菌門(mén)和酸桿菌門(mén)在各組群體中含量相對(duì)較低。

從屬的分類水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(表5)，各感染組芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、嗜冷桿菌屬的含量都高于對(duì)照組，而乳球菌屬、叢毛單胞菌屬(除了C群體)、乳酸桿菌屬的含量則明顯低于對(duì)照組。

表4 羅氏沼蝦抗病選育與非選育群體各組別肌肉組織樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)類及相對(duì)豐度 %

2.5 羅氏沼蝦抗病選育與非選育群體腸道組織和養(yǎng)殖水體微生物菌群分析

如表6所示，6個(gè)樣品中微生物主要分為3個(gè)門(mén)，分別是變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)。對(duì)感染成活率最低、最高的羅氏沼蝦抗病選育群體以及非抗病選育群體進(jìn)行取樣，其中腸道組織樣品Ⅲ(非選育群體E)的變形菌門(mén)含量最高(69.48%)，擬桿菌門(mén)含量最低(6.44%)；水樣H(非選育群體E)的變形菌門(mén)含量最低(23.90%)，擬桿菌門(mén)含量最高(67.56%)；腸道組織樣品Ⅱ(選育群體A)的厚壁菌門(mén)含量最高(33.54%)，水樣F(選育群體C)的厚壁菌門(mén)含量最低(3.03%)。

從屬的分類水平進(jìn)行分析可發(fā)現(xiàn)(表7)，水樣F(選育群體C)的優(yōu)勢(shì)菌群主要有黃桿菌屬(20.85%)、Aquibacter(21.75%)、赤桿菌屬(5.84%)、Perlucidibaca(8.60%)和Alishewanella(8.06%)；腸道組織樣品Ⅰ(選育群體E)的優(yōu)勢(shì)菌群主要有黃桿菌屬(52.60%)、腸桿菌屬(18.78%)和芽孢桿菌屬(4.00%)；水樣G(選育群體A)的優(yōu)勢(shì)菌群主要有黏著桿菌屬(31.54%)、Leisingera(10.22%)、Algoriphagus(6.79%)、假交替單胞菌屬(8.52%)和Ruegeria(6.33%)；腸道組織樣品Ⅱ(選育群體A)的優(yōu)勢(shì)菌群主要有黃桿菌屬(11.21%)、腸桿菌屬(30.87%)、芽孢桿菌屬(15.17%)、類芽孢桿菌屬(10.19%)和Carboxylicivirga(5.25%)；水樣H(非選育群體E)的優(yōu)勢(shì)菌群主要有黏著桿菌屬(10.37%)、Flavobacteriaceae unclassified(26.44%)、Leisingera(8.52%)、NS3a marine group(19.07%)和Algoriphagus(8.01%)；腸道組織樣品Ⅲ(非選育群體E)的優(yōu)勢(shì)菌群主要有腸桿菌屬(22.54%)、芽孢桿菌屬(10.37%)、類芽孢桿菌屬(6.97%)和Aquabacterium(7.45%)?？梢钥闯觯B(yǎng)殖水體和腸道組織中的細(xì)菌相對(duì)豐度不同，但也共有一些優(yōu)勢(shì)菌屬。

表5 羅氏沼蝦抗病選育與非選育群體各組別肌肉組織樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類及相對(duì)豐度 %

注：其中*為常見(jiàn)益生菌。

表6 羅氏沼蝦選育與非選育群體腸道組織和養(yǎng)殖水環(huán)境優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)類及相對(duì)豐度 %

表7 羅氏沼蝦選育與非選育群體腸道組織和養(yǎng)殖水環(huán)境優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬類及相對(duì)豐度 %

3 結(jié)論與討論

3.1 微生物多樣性分析

高通量測(cè)序技術(shù)是相對(duì)于第一代測(cè)序(Sanger法)技術(shù)，又稱新一代或第二代測(cè)序技術(shù)，具有測(cè)序通量高、準(zhǔn)確度高、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)[6]，為研究大規(guī)模環(huán)境樣品的菌群多樣性提供了強(qiáng)有力的工具。目前該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于淡水、海洋、土壤、動(dòng)物消化系統(tǒng)等環(huán)境微生態(tài)結(jié)構(gòu)的研究[7-10]。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)動(dòng)物消化道和養(yǎng)殖水環(huán)境相通，養(yǎng)殖水環(huán)境會(huì)直接影響水產(chǎn)動(dòng)物腸道組織的菌群結(jié)構(gòu)[11-12]。也有很多研究者認(rèn)為水產(chǎn)動(dòng)物消化道的菌群結(jié)構(gòu)具有相對(duì)獨(dú)立性，并不完全受養(yǎng)殖水環(huán)境的影響。張正等[7]研究發(fā)現(xiàn)，池塘養(yǎng)殖半滑舌鰨消化道菌群的細(xì)菌種類多樣性和菌群組成結(jié)構(gòu)都和池水中的細(xì)菌存在著明顯的不同，幾乎沒(méi)有相關(guān)性。王賢豐等[13]對(duì)擬穴青蟹的養(yǎng)殖水環(huán)境和腸道組織進(jìn)行了菌群多樣性分析，結(jié)果表明，擬穴青蟹腸道與其池塘養(yǎng)殖環(huán)境中菌群結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，但腸道菌群相對(duì)獨(dú)立，其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類與養(yǎng)殖環(huán)境中優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種類無(wú)關(guān)。本研究對(duì)感染成活率最高的抗病選育群體A、感染成活率最低的抗病選育群體C和非抗病選育群體E的腸道組織和養(yǎng)殖水體進(jìn)行了菌群多樣性比較，分析養(yǎng)殖水體是否會(huì)影響羅氏沼蝦腸道組織的菌群結(jié)構(gòu)，從而探討對(duì)其感染成活率產(chǎn)生的影響。研究結(jié)果表明，羅氏沼蝦腸道和養(yǎng)殖水環(huán)境中的菌群密切相關(guān)，但腸道菌群相對(duì)獨(dú)立，并不完全受養(yǎng)殖水環(huán)境的影響。本研究水環(huán)境中黏著桿菌屬、Aquibacter等含量相對(duì)較高，而在腸道組織中含量相對(duì)較低；水環(huán)境中腸桿菌屬、芽孢桿菌屬、乳球菌屬等的含量相對(duì)較低，而在腸道組織中相對(duì)較高。

隨著養(yǎng)殖過(guò)程中各種疾病的頻繁暴發(fā)，羅氏沼蝦的抗病選育工作顯得尤為重要，這其中益生菌是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。已有研究結(jié)果表明，在斑節(jié)對(duì)蝦飼料中添加芽孢桿菌能有效提高對(duì)蝦的生長(zhǎng)率和成活率，降低哈維氏弧菌對(duì)斑節(jié)對(duì)蝦的感染率[14]。張盛靜等[15]研究表明，在凡納濱對(duì)蝦飼料中添加芽孢桿菌能顯著提高對(duì)蝦抗哈維氏弧菌感染的能力，顯著降低對(duì)蝦腸道內(nèi)弧菌數(shù)量。孟霄鵬等[16]以類芽孢桿菌作為益生菌投喂到凡納濱對(duì)蝦的飼料中，結(jié)果表明，類芽孢桿菌明顯改善對(duì)蝦腸道的菌群組成，提高對(duì)蝦的抗病能力。本研究結(jié)果顯示，抗病選育群體A的感染成活率顯著高于抗病選育群體C，而B(niǎo)、C、D、E群體間則差異不顯著。比較各群體感染組肌肉組織中細(xì)菌的相對(duì)豐度可以發(fā)現(xiàn)，A組中類芽孢桿菌的含量最高，為8.95%，而C組中含量?jī)H為0.02%；除此之外，C組中芽孢桿菌的含量最低，為31.16%，而A、B、D和E組中芽孢桿菌的含量則差異不顯著。研究表明，芽孢桿菌和類芽孢桿菌可能是造成A群體和C群體感染成活率差異顯著的原因。為了進(jìn)一步分析產(chǎn)生顯著差異的原因，本研究對(duì)A群體和C群體的養(yǎng)殖池水和腸道組織進(jìn)行菌群多樣性分析。結(jié)果表明，A群體腸道組織中芽孢桿菌和類芽孢桿菌的相對(duì)豐度均顯著高于C群體，和分析肌肉組織得出的結(jié)論一致。比較A群體和C群體的養(yǎng)殖池水，芽孢桿菌和類芽孢桿菌的含量差異不顯著。關(guān)于芽孢桿菌和類芽孢桿菌能否提高羅氏沼蝦抗弧菌感染的能力，還需進(jìn)一步研究。

3.2 抗病選育及抗病力評(píng)價(jià)

近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖技術(shù)的不斷提高，羅氏沼蝦開(kāi)始由粗放養(yǎng)殖向集約化養(yǎng)殖發(fā)展，由此也帶來(lái)一系列問(wèn)題：養(yǎng)殖環(huán)境惡化，多種疾病暴發(fā)等等，給我國(guó)羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展造成了極大困擾。為了從根源上預(yù)防或解決病害問(wèn)題，需盡快培育出羅氏沼蝦抗病新品種。水產(chǎn)動(dòng)物抗病選育的常見(jiàn)方法有選擇育種、雜交育種、基因和分子標(biāo)記輔助選擇育種及轉(zhuǎn)基因育種等。無(wú)論何種選育方法，其最終目標(biāo)都是為了顯著提高水產(chǎn)動(dòng)物在經(jīng)歷病害暴發(fā)后的成活率，然而現(xiàn)實(shí)中很難模擬養(yǎng)殖環(huán)境下的病害暴發(fā)，一般采用測(cè)定感染或養(yǎng)殖成活率來(lái)直接反映抗病能力，也可以測(cè)定與疾病相關(guān)的免疫指標(biāo)來(lái)間接反映[17-21]。此外，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，一些抗病基因(如MHC基因Cyca-DAB1等位基因)的多態(tài)性往往也用來(lái)作為評(píng)價(jià)抗病性能的重要指標(biāo)[22-23]。目前的抗病選育工作更注重成活率的高低，但某些細(xì)菌性疾病并不會(huì)造成動(dòng)物的患病死亡，只會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物食欲減退，影響其生長(zhǎng)性能。與常規(guī)抗病選育方法相比，本研究采用的高通量測(cè)序技術(shù)，一方面可以通過(guò)測(cè)定不同時(shí)間段羅氏沼蝦體內(nèi)弧菌的含量直觀地反映各羅氏沼蝦群體的抗病能力，并輔助分析造成抗病能力產(chǎn)生顯著差異的原因；另一方面可以幫助淘汰體內(nèi)有病原菌的個(gè)體，同時(shí)結(jié)合各種性狀的表型值，為盡快選育出優(yōu)良品種提供保障。

綜上，通過(guò)分析羅氏沼蝦感染溶藻弧菌后體內(nèi)弧菌的含量，結(jié)合感染成活率結(jié)果，得出各群體的抗病性能為A>B>E>D>C。A群體的抗病能力與C群體差異顯著，B、C、D、E群體間差異均不顯著。羅氏沼蝦體內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)和養(yǎng)殖水環(huán)境密切相關(guān)，但又相對(duì)獨(dú)立；體內(nèi)芽孢桿菌和類芽孢桿菌的相對(duì)含量可能是造成A群體和C群體感染成活率差異顯著的原因。