李長(zhǎng)春，王 永，姚國(guó)新，戴余軍，王立華，李國(guó)元

(1.特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000； 2.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000)

隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，重金屬污染現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重，相比其他重金屬污染，土壤鎘污染現(xiàn)象在我國(guó)尤為突出，造成鎘污染事件時(shí)有發(fā)生[1-2]。鎘等重金屬可以被植物吸收，并通過(guò)植食性昆蟲(chóng)和它們的捕食者在食物鏈中積累和傳遞，從而對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成嚴(yán)重的威脅[3-4]。鎘通過(guò)直接和間接的毒性作用對(duì)昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生多效性和復(fù)雜的影響，如發(fā)育時(shí)間、存活率、生長(zhǎng)速率、個(gè)體大小、產(chǎn)卵量、卵粒大小、孵化率等[5-7]。鎘對(duì)人體具有毒性大、蓄積性強(qiáng)、生物半衰期長(zhǎng)等特點(diǎn)，易引起腎臟、脾臟、肺臟等軟組織的損傷，并可導(dǎo)致癌癥的發(fā)生[8]。由于環(huán)境中鎘積累水平的不斷提高，鎘的生態(tài)毒理學(xué)引起了人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[9]。

目前對(duì)重金屬毒性污染監(jiān)測(cè)主要采用化學(xué)分析方法，雖然簡(jiǎn)單、直接，但不能反映重金屬對(duì)生物體和生態(tài)環(huán)境的可能毒害和綜合效應(yīng)[10]。長(zhǎng)期暴露于亞致死劑量重金屬環(huán)境導(dǎo)致的人類疾病難以及時(shí)診斷，如日本的疼痛病和水俁病[11]。一些研究表明，指示生物可用來(lái)指示重金屬污染物的來(lái)源、遷移轉(zhuǎn)化及時(shí)空分布等，成為環(huán)境污染監(jiān)測(cè)、評(píng)價(jià)與治理的重要輔助工具[10]。目前，關(guān)于土壤重金屬指示生物的研究主要集中于植物，如車前草[12]，以及土壤表層動(dòng)物，如蚯蚓[13]、蜘蛛[14]。果蠅是一種重要的模式生物，具有飼養(yǎng)簡(jiǎn)單、繁殖周期短、廉價(jià)易得等特點(diǎn)。本研究測(cè)定了鎘在擬果蠅體內(nèi)的積累及對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響，探討了鎘對(duì)果蠅的生態(tài)毒理效應(yīng)，為利用果蠅作為鎘污染指示生物提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

擬果蠅(Drosophilasimulans)由湖北大學(xué)行為生態(tài)與進(jìn)化生物學(xué)研究中心提供。恒溫光照培養(yǎng)箱(MJX-2508-Z)由上海博迅實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，微波消解儀(WX4000N)由成都奧譜勒儀器有限公司生產(chǎn)，原子吸收分光光度計(jì)(TAS-990AFC)由北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)。試驗(yàn)用HNO3和H2O2均為優(yōu)級(jí)純，標(biāo)準(zhǔn)鎘溶液購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer公司。

1.2 果蠅的飼養(yǎng)

果蠅于5 cm × 12 cm 平底玻璃試管中培養(yǎng)。置于(23±1)℃、相對(duì)濕度60%～80%、光周期14 h/10 h (L/D)的恒溫光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基配方為：玉米粉62.5 g、紅糖50 g、酵母粉7.5 g、瓊脂粉5 g、苯甲酸鈉0.1 g、丙酸2 mL、雙蒸水500 mL。

1.3 果蠅的染毒處理

將不同體積的CdCl2溶液加入到果蠅的培養(yǎng)基中，使Cd2+終質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、80 mg/L，以無(wú)Cd2+添加的培養(yǎng)基作對(duì)照(CK)。用乙醚麻醉后，收集無(wú)污染培養(yǎng)基上8 h內(nèi)羽化出的果蠅成蟲(chóng)接種于培養(yǎng)基含鎘的平底玻璃試管和對(duì)照管中，每管接種雌雄果蠅各10頭，5 d后清除果蠅成蟲(chóng)。每處理6次重復(fù)。

1.4 鎘含量的測(cè)定

取羽化后第2天的果蠅樣品于60 ℃烘箱烘烤24 h至恒質(zhì)量，分別加入2% HNO3和30% H2O2各2 mL后，置微波消解儀于160 ℃、功率5 kW條件下消解30 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾后，用原子吸收光譜儀測(cè)定鎘含量。每處理3次重復(fù)。所有試驗(yàn)用品使用前用2% HNO3浸泡24 h，并用ddH2O清洗。

1.5 生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定

每天早上8:00定時(shí)檢查，記錄每管果蠅開(kāi)始化蛹和開(kāi)始羽化時(shí)間；分別在各管出現(xiàn)第1個(gè)蛹和成蟲(chóng)后的第5天記錄各管成蛹的個(gè)數(shù)和羽化的果蠅數(shù)；接種后第10天每組隨機(jī)選取10頭幼蟲(chóng)稱質(zhì)量，羽化當(dāng)天隨機(jī)選擇各組雌雄成蟲(chóng)各10頭稱質(zhì)量；分別記錄各處理組雌雄果蠅數(shù)量，計(jì)算性別比，性別比=雌果蠅數(shù)/果蠅總數(shù)。

1.6 脂肪含量的測(cè)定

用氯仿抽提法[15]測(cè)定果蠅體內(nèi)的脂肪含量。取羽化后第2天的雌雄果蠅各50頭烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱量其干質(zhì)量后置于含有5 mL氯仿的離心管中浸泡3次，每12 h更換氯仿一次，然后將這些果蠅從溶液中取出，烘干后稱量。每處理3次重復(fù)。果蠅脂肪含量為抽提前后質(zhì)量差與抽提前質(zhì)量的百分比。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。不同處理間的差異比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，不同處理間平均數(shù)的差異顯著性采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘在果蠅體內(nèi)的積累量

雌雄果蠅體內(nèi)的鎘含量均隨培養(yǎng)基中Cd2+質(zhì)量濃度的增加而顯著增加(雌:F=125.216,df=5,P<0.001; 雄:F=237.918,df=5,P<0.001) (圖1A)。Pearson相關(guān)性指數(shù)分析顯示，雌雄果蠅體內(nèi)的鎘含量均與培養(yǎng)基的Cd2+質(zhì)量濃度顯著相關(guān)(雌：R2=0.820 4，P<0.001；雄：R2=0.902 2，P<0.001) (圖1B)。

2.2 鎘對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響

果蠅幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間均隨Cd2+質(zhì)量濃度的增高而呈延長(zhǎng)的趨勢(shì)，各處理組幼蟲(chóng)化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間都顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。10、20、40 mg/L Cd2+脅迫下果蠅化蛹時(shí)間差異不顯著。

不同字母表示不同處理間差異顯著 (P<0.05)，下同

5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L Cd2+處理組之間，10 mg/L、20 mg/L和40 mg/L Cd2+處理組之間，以及40 mg/L 和80 mg/L Cd2+處理組之間果蠅羽化時(shí)間差異不顯著。果蠅的化蛹量和羽化量隨Cd2+質(zhì)量濃度的增加呈減小的趨勢(shì)，各處理組的化蛹量和羽化量均顯著低于對(duì)照(P<0.05)。果蠅幼蟲(chóng)和雌雄成蟲(chóng)質(zhì)量隨Cd2+質(zhì)量濃度的增加而顯著降低(幼蟲(chóng)：F=319.030,df=5,P<0.001; 雌：F=49.663,df=5,P<0.001;雄：F=61.572,df=5,P<0.001)。5 mg/L和10 mg/L Cd2+脅迫對(duì)果蠅成蟲(chóng)質(zhì)量的影響差異不顯著(雌：P=0.332; 雄：P=0.233) (表1)。

表1 鎘對(duì)果蠅生長(zhǎng)發(fā)育的影響

2.3 鎘對(duì)果蠅體內(nèi)脂肪含量的影響

Cd2+脅迫下果蠅體內(nèi)的脂肪含量顯著下降(雌：F=3.807,df=5,P=0.027;雄：F=6.897,df=5,P=0.003)，相鄰質(zhì)量濃度處理間差異不顯著，較高質(zhì)量濃度處理間沒(méi)有顯著性差異，但雌蠅在Cd2+質(zhì)量濃度大于20 mg/L，雄蠅在Cd2+質(zhì)量濃度大于10 mg/L時(shí)，體內(nèi)脂肪含量相比對(duì)照顯著降低(P<0.05) (圖2)。

2.4 鎘對(duì)果蠅性別比的影響

5 mg/L 和10 mg/L Cd2+對(duì)果蠅的性別比沒(méi)有顯著影響(P>0.05)，20 mg/L、40 mg/L 和80 mg/L Cd2+處理下果蠅的性別比顯著高于對(duì)照，20 mg/L和80 mg/L Cd2+處理組果蠅的性別比顯著高于5 mg/L和10 mg/L Cd2+處理組(P<0.05) (圖3)，表明高濃度的Cd2+對(duì)雄性果蠅的抑制作用大于雌性，造成雄性果蠅成蟲(chóng)比例顯著降低。

圖2 鎘對(duì)果蠅體內(nèi)脂肪含量的影響

圖3 鎘對(duì)果蠅性別比的影響

3 結(jié)論與討論

環(huán)境中的重金屬可以通過(guò)呼吸、攝食、表皮接觸等途徑進(jìn)入生物體內(nèi)。本研究中，果蠅體內(nèi)的鎘含量隨培養(yǎng)基中的Cd2+質(zhì)量濃度增加而顯著增加，存在顯著的濃度-效應(yīng)關(guān)系。這與重金屬在其他無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的積累規(guī)律相似，如食物中過(guò)量的Cd2+能夠通過(guò)食物鏈在擬水狼蛛(Piratasubpiraticus)體內(nèi)積累，積累量隨用于飼喂蜘蛛的黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)培養(yǎng)基中Cd2+濃度的增加而增加[16]；棕尾別麻蠅(Boettcheriscaperegrina)取食的Cd2+大部分積累在體內(nèi)，Cd2+積累量隨著取食時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，經(jīng)過(guò)化蛹、羽化，直至成為成蟲(chóng)后，體內(nèi)仍維持較高的Cd2+濃度[17]。

暴露于含不同質(zhì)量濃度Cd2+培養(yǎng)基中的一些果蠅雖然能完成整個(gè)發(fā)育歷期，但它們的生長(zhǎng)和發(fā)育卻受到了顯著抑制，這與鎘對(duì)擬環(huán)紋豹蛛(Pardosapseudoannulata)[18]、馬利筋長(zhǎng)蝽(Oncopeltusfasciatus)[5]、舞毒蛾(Lymantriadispar)[6]等其他無(wú)脊椎動(dòng)物的影響類似，如飲用水含Cd2+的擬環(huán)紋豹蛛發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)，質(zhì)量顯著降低，產(chǎn)卵量顯著減少[18]。重金屬可以通過(guò)直接與生物分子作用，破壞重要的生物學(xué)過(guò)程，影響正常代謝，或通過(guò)間接作用引起細(xì)胞內(nèi)活性氧的過(guò)量產(chǎn)生而造成氧化損傷，對(duì)生物體產(chǎn)生脅迫[8,19-21]。同時(shí)，在抵御重金屬脅迫時(shí)，生物體的解毒過(guò)程需要耗費(fèi)更多的能量，也會(huì)抑制其生長(zhǎng)和發(fā)育[22]。鎘脅迫下，雌雄果蠅體內(nèi)的脂肪含量均顯著降低，可能是果蠅抵御重金屬的脅迫，造成體內(nèi)沒(méi)有多余脂類的積累，也可能是體內(nèi)脂類物質(zhì)相關(guān)的代謝受到了重金屬的抑制[23]。低質(zhì)量濃度的Cd2+對(duì)果蠅的性別比沒(méi)有顯著影響，這與吳國(guó)星等[24]在研究Cd2+對(duì)棕尾別麻蠅性別比的影響時(shí)得到的結(jié)果相似。但高質(zhì)量濃度的Cd2+脅迫下，果蠅的性別比顯著增加，雌果蠅數(shù)量顯著多于雄果蠅，推測(cè)雄果蠅有更多的卵沒(méi)有成功孵化，表明雌性相比雄性對(duì)重金屬具有更強(qiáng)的抗性[18]。

綜上所述，果蠅體內(nèi)的鎘含量與培養(yǎng)基中的Cd2+質(zhì)量濃度顯著相關(guān)，鎘的積累導(dǎo)致果蠅的化蛹時(shí)間和羽化時(shí)間顯著延長(zhǎng)，化蛹量和羽化量顯著減少，幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)質(zhì)量以及體內(nèi)脂肪含量顯著降低，表明果蠅有潛力成為環(huán)境重金屬污染監(jiān)測(cè)的指示生物，但由于室外環(huán)境的復(fù)雜性和多樣性，其適用性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。