李亞港

摘 要：色譜聯(lián)用技術(shù)是將色譜分離裝置與各種檢測(cè)裝置通過(guò)接口技術(shù)連接后而成的一種新型的儀器分析技術(shù)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC/MS）由于能夠分離極性的、離子化的、不易揮發(fā)的和熱不穩(wěn)定的化合物，具有更廣闊的應(yīng)用前景。色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是代謝組學(xué)的主要分析技術(shù)平臺(tái)，隨著LC/MS技術(shù)的不斷發(fā)展，必將會(huì)更多地應(yīng)用于代謝組學(xué)方面，為其分析提供更多的方法與方便。本文從當(dāng)前代謝組學(xué)研究平臺(tái)技術(shù)的角度，系統(tǒng)地介紹液質(zhì)聯(lián)用方法的基本原理與代謝組學(xué)的關(guān)系。

關(guān)鍵詞：LC/MS；代謝組學(xué)；藥物分析

一、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的原理

（1）LC色譜單元部分

①液-固色譜法。液-固色譜法是使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5～10um。適用于分離分子量為200～1000的非離子型化合物，因此這種色譜法常用于分離同分異構(gòu)體。

②液-液色譜法。液-液色譜法是一種基于被測(cè)物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間的相對(duì)溶解度的差異，通過(guò)溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行分配以實(shí)現(xiàn)分離的方法。按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法（NPC）和反相色譜法（RPC）。一般的分離方法都是反相色譜法。

③離子交換色譜法。離子交換色譜法的固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面末端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱陽(yáng)離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。

④離子對(duì)色譜法。又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而改善分離效果。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。

⑤排阻色譜法。排阻色譜法的固定相是有一定孔徑的多孔性填料，利用分子篩對(duì)分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用于分離如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等高分子化合物。

（2）質(zhì)譜單元部分

質(zhì)譜分析的原理是先將待測(cè)化合物的分子離子化，然后在電場(chǎng)和磁場(chǎng)共同的作用下，將所得到的不同質(zhì)荷比的分子離子和碎片離子進(jìn)行分離，從而能夠得到一組特征質(zhì)譜圖，由于質(zhì)譜分析特征性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，所以作為未知組分分析的一個(gè)有效手段和工具，經(jīng)常被用于定性分析。

小型質(zhì)譜儀的質(zhì)譜檢測(cè)器（MSD）是最早被用于與GC聯(lián)用的，而MSD與LC的聯(lián)用則是在后才成熟和發(fā)展起來(lái)的。

（3）連接部分

由于液相色譜的流動(dòng)相流速較大，而質(zhì)譜需要在真空的環(huán)境下工作，因此兩者如何連接成為L(zhǎng)C/MS技術(shù)的關(guān)鍵。目前的LC/MS接口主要有移動(dòng)帶（MB）、直接液體引入（DLI）、熱噴霧（TSP）、快原子碰撞（FAB）、顆粒束（PB）、大氣壓（API）接口等。使用最廣的接口設(shè)備是大氣壓接口。

二、常用液相色譜-質(zhì)譜儀介紹

常用的4種LC/MS包括超高壓液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀（UPLC/Q-MS）、液相色譜-四極桿-離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC/Q-Trap-MS-MS）、常規(guī)高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀（LC/Q-MS）、超高壓液相色譜-四極桿-時(shí)間飛行串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC/Q-TOF-MS-MS）。

（1）液相系統(tǒng)（LC系統(tǒng)）。

LC系統(tǒng)包括常規(guī)的LC和UPLC。UPLC在HPLC的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，它涵蓋了小顆粒填料，非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量，靈敏度及色譜峰的容量。與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC具有以下優(yōu)點(diǎn)。

①超高分離度。UPLC用1.7μm顆粒提高了分離能力，可以分離出更多的色譜峰，從而對(duì)樣品提供的信息達(dá)到了一個(gè)新的水平。而且又最大地縮短了開發(fā)方法所需的時(shí)間。

②超高速度。UPLC系統(tǒng)在HPLC系統(tǒng)3倍的流速下進(jìn)行而保持柱效不變。其快速分析亦節(jié)省了以往一向耗時(shí)的方法驗(yàn)證的時(shí)間，使方法驗(yàn)證變得簡(jiǎn)單快速。

③超高靈敏度。UPLC使用小顆粒技術(shù)可以得到更高的柱效、更窄的色譜峰寬，即更高的靈敏度。同樣，當(dāng)UPLC用于快速分析、用較短色譜柱而使柱效不變時(shí)，色譜峰高會(huì)相應(yīng)增加。因此，使用UPLC技術(shù)，不僅可以在保持與HPLC相同分離度時(shí)提高峰高，而且在改善分離度的同時(shí)亦可提高峰高即靈敏度。

（2）質(zhì)譜系統(tǒng)（MS系統(tǒng)）

構(gòu)成MS系統(tǒng)的5個(gè)基本部分的組成是相同的，即接口，離子源，真空系統(tǒng)，檢測(cè)系統(tǒng)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

①電離源。在液質(zhì)聯(lián)用的發(fā)展過(guò)程中，出現(xiàn)了各種電離源，主要有電噴霧電離源（ES），大氣壓化學(xué)電離源（APCI）和大氣壓光化學(xué)電離源（APPID）。

②真空系統(tǒng)。真空系統(tǒng)中包括了離子透鏡，質(zhì)量分析器和檢測(cè)器3個(gè)主要部分。不同的離子源在不同的設(shè)計(jì)中一般都是有2～3個(gè)不同的真空區(qū)，并由附加的機(jī)械泵抽氣形成。

③質(zhì)量分析器。質(zhì)量分析器是LC/MS組合分類中主要的標(biāo)準(zhǔn)之一。質(zhì)量分析器是依據(jù)不同方式將離子源中生成的樣品離子按質(zhì)荷比m/z的大小分開的儀器，是質(zhì)譜儀的重要組成部件，位于離子源和檢測(cè)器之間[1]。常用的質(zhì)量分析器有：?jiǎn)尉劢官|(zhì)量分析器、雙聚焦質(zhì)量分析器、四級(jí)桿質(zhì)量分析器、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器、離子冊(cè)質(zhì)量分析器，以及離子回旋共振質(zhì)量分析器等，而與LC系統(tǒng)進(jìn)行相連的質(zhì)量分析器主要是：四級(jí)桿、離子阱、飛行時(shí)間及傅立葉變換。

三、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在代謝組學(xué)中的應(yīng)用

代謝組學(xué)（metabonomics/metabolomics）是效仿基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思想[2]，對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，尋找代謝物與病理生理變化關(guān)系的研究方式。研究對(duì)象大都是相對(duì)分子質(zhì)量1000以內(nèi)的小分子物質(zhì)[3，4]。代謝組學(xué)分析方法要求具有高靈敏度、高通量和無(wú)偏向性的特點(diǎn)，因此單一的分離、分析技術(shù)難以滿足這一要求。因此，越來(lái)越多的分離、分析手段及其組合出現(xiàn)在代謝組學(xué)的研究中[5]。從總體而言，由于LC/MS較高的靈敏度和較寬的動(dòng)態(tài)范圍，其已被越來(lái)越多地應(yīng)用于代謝組學(xué)研究。

HPLC是代謝組學(xué)研究的重要工具，可靠的HPLC技術(shù)將在代謝組學(xué)研究中發(fā)揮不可替代的作用。目前的研究已證明基于HPLC的代謝組學(xué)有良好的前景。高分辨HPLC/MS-MS系統(tǒng)的廣泛可靠性在獲得代謝指紋譜的分析方法逐漸成為重要的手段[6]。

參考文獻(xiàn)

[1]邱永紅.質(zhì)量分析器新理論初探[J].分析儀器，2014（3）：81-87.

[2]Nicholson J K，Wilson I D.Nat.Rev.Drug Discovery，2003，2（8）：668-676.

[3]賈偉，敖平，王曉艷.科學(xué)，2012，64（6）：12-15.

[4]鄒忠杰，袁經(jīng)權(quán)，龔夢(mèng)鵑，沈志濱.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（4）：424-428.

[5]許彬，王海龍，等。代謝組學(xué)分析技術(shù)及其在幾類重大疾病研究中的應(yīng)用[U].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2006，25（5）：128-132

[6]賈偉.醫(yī)學(xué)代謝組學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2011：193-218.

（作者單位：鄭州大學(xué)）