李春燕 傅紅梅 李嫣紅 譚毅剛 劉 欣

世界衛(wèi)生組織在1992年將同時耐異煙肼和利福平的結(jié)核病定義為耐多藥結(jié)核病，耐多藥結(jié)核病存在治療周期長、高治療成本和低治愈率等問題[1]?？焖俚貙Ψ种U菌異煙肼及利福平耐藥性測定，對治療方案的制定和結(jié)核病流行非常重要的意義。隨著分子生物學的發(fā)展，開發(fā)出了多種快速、客觀、準確的耐藥基因檢測新診斷方法，如線性探針技術(shù)、基因芯片技術(shù)及探針熔解曲線技術(shù)等[2]。

近年來已有一些實驗室的研究分析熔解曲線技術(shù)對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的測定。本文從臨床應(yīng)用角度觀察，對PCR熔解曲線法結(jié)果總結(jié)，以培養(yǎng)法藥敏試驗作為金標準，分析熔解曲線法檢測利福平、異煙肼耐藥性的敏感度和特異度,探討其在耐藥結(jié)核病的診斷意義和應(yīng)用價值。

1 對象與方法

1.1 對象

納入廣州市胸科醫(yī)院2016年6月-2016年11月住院期間痰涂片找到分枝桿菌的200例患者，其中男149例，女51例，年齡16～85歲，其中初治患者147例，復治患者53例。

1.2 方法

1.2.1 標本的收集 對以上200例患者痰涂片抗酸染色陽性的痰標本進行分離培養(yǎng)，使用BACTECTMMGIT960TM全自動分枝桿菌培養(yǎng)儀。痰標本分離培養(yǎng)按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[3]進行。

1.2.2 藥敏試驗 對分離培養(yǎng)出的菌株進行結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定并進行異煙肼、利福平等藥敏實驗，操作均按照中國防癆協(xié)會《結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》進行。

1.2.3 PCR熔解曲線法檢測利福平和異煙肼耐藥性 按照PCR熔解曲線法結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)和異煙肼耐藥突變檢測試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)說明書操作。簡述如下：①配制PCR反應(yīng)液。PCR反應(yīng)液配液標準：取n×19.6 μl INH或RIF PCR Mix A和n×0.4 μl TB酶混合液加入到1.5 ml離心管中，振蕩混勻，3 000 g離心數(shù)秒；另取n×19.6 μl INH或RIF PCR Mix B和n×0.4 μl TB酶混合液加入到1.5 ml離心管中，振蕩混勻，3 000 g離心數(shù)秒。②樣品提取及加樣。液體培養(yǎng)基中生長的結(jié)核分枝桿菌取1 ml，10 000 g離心15 min，丟棄上清液并在250 μl TBDNA提取液中重懸細菌；封口膜封口，99℃加熱20 min，14 000 g離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的1.5 ml離心管，上清為PCR擴增模版；用微量加液器向每支PCR薄壁反應(yīng)管中加入相應(yīng)提取樣品或陰/陽性對照品5 μl；將加入模版的PCR薄壁反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至PCR擴增區(qū)，放入PCR擴增儀進行PCR擴增和熔解分析。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 熔解曲線法以培養(yǎng)藥敏試驗為金標準計算靈敏度和特異度，見表1。

表1 熔解曲線法和培養(yǎng)藥敏試驗比較

注：靈敏度=A/(A+C)×100% 特異度=D/(B+D)×100% 一致性=(A+D)/(A+B+C+D)×100%

使用統(tǒng)計分析軟件SPSS19.0版進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為檢驗水平，對熔解曲線法和培養(yǎng)藥敏試驗檢測結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼的耐藥性檢測結(jié)果進行一致性檢驗。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌核酸檢測及培養(yǎng)菌鑒定結(jié)果

見表2。

表2 核酸檢測及培養(yǎng)菌鑒定結(jié)果 (n)

2.2 分枝桿菌耐藥基因檢測的結(jié)果

PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌核酸陽性的病例共175例，其中初治患者134例，復治患者41例。

2.2.1 初治134例患者中，痰培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長的有106例，此106例納入一致性分析(見表3、表4)。

初治患者中痰培養(yǎng)藥敏試驗提示利福平、異煙肼均耐藥(MDR)的共有7例，其中熔解曲線法檢測利福平、異煙肼均耐藥的6例，1例為利福平耐藥而異煙肼敏感。

2.2.2 復治41例患者中，痰培養(yǎng)有結(jié)核分枝桿菌生長的有36例，此時36例納入一致性分析(見表5、表6)。

表3 初治患者耐藥性測定 (n)

注：R表示耐藥S表示敏感

表4 初治患者熔解曲線法檢測耐藥的靈敏度,特異度,陽性預測值,陰性預測值 (%)

注：1)表示P值< 0.001

表5 復治患者耐藥性測定 (n)

注：R表示耐藥S表示敏感

表6 復治患者熔解曲線法檢測耐藥的靈敏度,特異度,陽性預測值,陰性預測值 (%)

注：1)表示P值< 0.001

復治患者中痰培養(yǎng)藥敏試驗示利福平、異煙肼均耐藥(MDR)的有15例，其中6例PCR熔解曲線法檢測出利福平、異煙肼均耐藥， 6例PCR熔解曲線法檢測利福平耐藥異煙肼敏感，3例PCR熔解曲線法檢測利福平及異煙肼均敏感。

3 討論

結(jié)核分枝桿菌耐藥性呈逐年上升趨勢, 異煙肼和利福平作為主要抗結(jié)核一線藥物, 其耐藥性檢測對于臨床結(jié)核病藥物治療具有重要意義。根據(jù)本文臨床觀察分析，在初治患者中，PCR溶解曲線法與培養(yǎng)藥敏法相比，熔解曲線法在分枝桿菌檢測利福平和異煙肼耐藥上具有很高的靈敏性和特異性，檢測異煙肼、利福平耐藥性的結(jié)果高度一致，PCR熔解曲線法可應(yīng)用于臨床利福平和異煙肼耐藥的快速檢測和篩查[4]。在復治菌陽患者中， PCR熔解曲線法檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥情況與培養(yǎng)藥敏試驗也高度一致，可應(yīng)用于臨床利福平耐藥的快速檢測和篩查。同時結(jié)果顯示在初治患者中熔解曲線法檢測出利福平耐藥的共有8例，其中7例培養(yǎng)藥敏為MDR，復治患者中熔解曲線法檢測出利福平耐藥的有15例，其中12例培養(yǎng)藥敏為MDR。PCR熔解曲線法檢測出利福平耐藥，不排除耐多藥可能，建議根據(jù)病情及時調(diào)整抗結(jié)核方案，盡早按耐多藥結(jié)核方案治療。

但是復治患者PCR熔解曲線技術(shù)檢測異煙肼耐藥性與培養(yǎng)藥敏法相比，熔解曲線法檢測檢測出異煙肼耐藥性的靈敏度只有35%，一致率只有55.56%?？紤]可能原因：①復治的肺結(jié)核患者經(jīng)反復使用含異煙肼方案抗結(jié)核治療，治療過程中藥物選擇壓的作用下產(chǎn)生突變，出現(xiàn)一些核酸序列改變，有些核酸序列改變并不引起氨基酸改變；而熔解曲線法只是篩查核酸序列而不是氨基酸序列，有些不引起氨基酸改變的突變也會被判斷為突變型，故報告為突變的結(jié)果并不絕對表示耐藥。②結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的耐藥機制尚未完全明確，耐藥突變所涉及的基因、位點、突變類型繁多，復治患者在治療過程中出現(xiàn)的耐藥突變更復雜，熔解曲線法僅檢測結(jié)核分枝桿菌由ahpC啟動子區(qū)(-44～-30以及-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～-8)位點和katG315密碼子突變引起的耐藥，由其他基因或者基因區(qū)引起的突變以及其他異煙肼耐藥機制引起的耐藥不能檢測。探針未完全包含耐異煙肼結(jié)核分枝桿菌的基因突變區(qū)，為提高檢測靈敏度還需覆蓋更多基因突變區(qū)[5]。③本組復治患者的樣本量較小，也是造成結(jié)果差異的原因，需要擴大標本量研究。根據(jù)結(jié)果對PCR熔解曲線檢測耐異煙肼的復治患者，仍有異煙肼敏感可能，而熔解曲線檢測異煙肼敏感的復治患者，也可能是耐藥。故對于復治患者，檢測到單純異煙肼耐藥，需結(jié)合臨床療效再判斷；合并利福平耐藥，考慮MDR，盡早予耐多藥方案治療。

本組中有部分痰培養(yǎng)陰性，考慮因?qū)嶒炇乙蛩貙毦膿p傷及細菌自身活性因素等多方面影響，痰培養(yǎng)可出現(xiàn)痰涂片陽性培養(yǎng)陰性(SPCN現(xiàn)象)[6]。部分培養(yǎng)陽性卻沒有藥敏結(jié)果，考慮由于含雜菌或菌量較少不適宜藥敏。PCR熔解曲線分析檢測的是核酸序列，細菌的損傷及活性下降對結(jié)果影響較少，故探針熔解曲線分析更能準確的檢測出結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌生長十分緩慢，培養(yǎng)藥敏法需要較長時間才能獲取藥敏結(jié)果，常常造成MDR-TB 的傳播和患者治療的延遲[5]。而PCR熔解曲線分析技術(shù)檢測能快速檢測出結(jié)果，可在患者出院前提供了耐藥檢測的結(jié)果。與培養(yǎng)藥敏試驗相比, PCR熔解曲線檢測技術(shù)在應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌耐藥的快速檢測時有較高的陽性檢出能力, 同時更加簡便、快速[7]。

綜上所述，與培養(yǎng)藥敏試驗相比，PCR熔解曲線法檢測方法簡單快速，準確性高，可用于初治患者利福平、異煙肼耐藥性的快速檢測和復治患者利福平耐藥性的快速檢測，并可用于MDR-TB快速篩查，可指導臨床用藥；但對復治患者異煙肼耐藥檢測靈敏度不夠，為提高檢測靈敏度還需覆蓋更多基因突變區(qū)。