張偉紅 徐邦牢 楊惠寬 陳 斌 張 婷 吳 斌 唐露丹 胡曉琳

EDTA 依賴性血小板假性減少(EDTA-dependent pseudothrombocytopenia, EDP)是指在健康群體和各種病人由于抗血小板自身抗體在EDTA 存在條件下引起血小板聚集，在全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀檢測(cè)時(shí)血小板計(jì)數(shù)發(fā)生假性減少的現(xiàn)象。由于全自動(dòng)血球分析儀很難對(duì)這些聚集血小板進(jìn)行分類鑒別，儀器只對(duì)此進(jìn)行提示報(bào)警，如巨大血小板、大血小板或血小板聚集，此類患者即使用世界衛(wèi)生組織推薦的草酸銨稀釋液血小板人工計(jì)數(shù)方法，在顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)血小板數(shù)也會(huì)假性減少，存在較大的隱蔽性，使病人再做不必要的檢查項(xiàng)目，易造成誤診誤治[1-3]，已引起臨床廣泛關(guān)注。人類血小板抗原(Human platelet alloantigen，HPA)是血小板膜糖蛋白上的抗原表型，是血小板特有的抗原決定簇，目前已鑒定出24個(gè)HPA抗原其中23個(gè)HPA抗原基因多態(tài)性的分子生物學(xué)基礎(chǔ)已闡明[4]。血小板膜糖蛋白在血小板粘附、活化、聚集和血栓形成過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中導(dǎo)致血小板聚集的因素均依賴血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的活化，活化的GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合是血小板聚集的最后通路。有學(xué)者對(duì)原發(fā)免疫性血小板減少癥患者GPⅡb/Ⅲa 抗體水平進(jìn)行了并探討[5]，也有學(xué)者對(duì)血小板膜糖蛋白基因多態(tài)性與冠心病關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究[6]。EDTA 依賴性血小板假性減少的發(fā)生機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展，主要集中在相關(guān)的免疫球蛋白方面的研究，在基因多態(tài)性方面研究較少，本課題在群體水平分析健康人和EDTA 依賴性血小板假性減少患者GP Ⅱb/Ⅲa 基因多態(tài)性，探討其與EDTA 依賴性血小板假性減少發(fā)生的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

分別收集2016年10月-2017年10月住院部近三個(gè)月無(wú)輸血史確診為EDTA依賴性假性血小板減少癥(EDP)患者29例為實(shí)驗(yàn)組，其中男16例，女13例，年齡12～60歲，平均年齡41.0歲。收集無(wú)血小板減少、血小板聚集病史健康體檢人群21例為對(duì)照組，其中男12例，女9例，年齡12～50歲，平均年齡35.0歲。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本 抽取靜脈血于EDTA-K2抗凝半小時(shí)內(nèi)在全自動(dòng)血球分析儀進(jìn)行血小板數(shù)的檢測(cè)并做人工推片觀察血小板分布情況，檢測(cè)完EDTA-K2抗凝血置于冰箱2～8℃保存送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因多態(tài)性分析。

1.2.2 儀器試劑 XE-5000全自動(dòng)血球分析儀、ABI PCR儀、計(jì)量檢測(cè)儀器有限公司HS-800D數(shù)顯恒溫水浴鍋、Syngene凝膠成像儀、ABI測(cè)序儀等。XE-5000全自動(dòng)血球分析儀試劑和質(zhì)控均為原廠試劑，引物、PfuDNA Polymerase 高溫聚合酶、PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒和DNA提取試劑盒等均為生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.3 結(jié)果分析

1.3.1 引物序列

HPA抗原系統(tǒng)HPA等位基因GP膜糖蛋白 上下游引物HPA-3HPA-aHPA-bGPⅡbrs5911-F5' GAGCCTGCTCACTACGAGAACTG 3' 61rs5911-R5' AGGTAAGAGCTGGGTGGAAGAAA 3' 61.5 383-638=256HPA-6HPA-aHPA-bGPⅢars13306487-F5' GGCAATGGGACCTTTGAGTGT 3' 61.2rs13306487-R5' CTATGTTTCCAGTGGTTGCAGGTAT 3' 61.8 136-470=335

1.3.2 PCR反應(yīng)體系：25 μL體系的配制: 模板1 μL, 引物Fi 0.5 μl, 引物Ri0.5 μl, dNTP 10 mM 0.5 μl, Taq Buffer 2.5 μl, Taq酶(5 U/μl)0.2 μl,水20 μl。

1.3.3 PCR反應(yīng)條件 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，程序如下：在95 ℃下進(jìn)行預(yù)變性 3 min，然后在 94 ℃下進(jìn)行變性 30 s，在 58 ℃ 30 s進(jìn)行退火處理，在72 ℃下延伸持續(xù) 30～60 s，循環(huán)數(shù)35個(gè)。修復(fù)延伸72 ℃ 10 min。

1.3.4 1.5%TAE瓊脂糖電泳 150 V、100 mA 20 min電泳觀察(見(jiàn)電泳圖)

1.3.5 測(cè)序 用雙脫氧鏈終止法分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的GPⅡb HPA-3和GPⅢa HPA-6基因多態(tài)性。

Marker 前四個(gè)為GPⅡb基因引物隨機(jī)取樣，后四個(gè)為GPⅢa基因引物隨機(jī)取樣

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅡbHPA-3 (rs5911)不同基因型結(jié)果比較

2.2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅢa HPA-6(rs13306487)和其下一位點(diǎn)基因型結(jié)果比較

2.3 GPⅢa HPA-6 rs13306487位點(diǎn)后一位雜合基因型A/G在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組結(jié)果比較

3 討論

血小板膜糖蛋白覆蓋于血小板質(zhì)膜表面上，在血小板活化和血栓的形成中發(fā)揮重要作用[7‐8]。目前已發(fā)現(xiàn)血小板膜糖蛋白的5種血小板膜受體，血小板膜糖蛋白與受體在一定條件下形成復(fù)合體從而調(diào)節(jié)血小板性血栓的形成，其中GP Ⅱb HPA-3和GP Ⅲa HPA-6基因具有關(guān)鍵作用。至今EDTA依賴性假性血小板減少癥發(fā)生機(jī)制并未明確，有報(bào)道認(rèn)為EDTA依賴性假性血小板減少癥患者體內(nèi)存在抗血小板自身抗體是免疫球蛋白家族IgM 、IgG或IgA，這些免疫球蛋白直接針對(duì)隱藏的抗原決定簇，而這些抗原決定簇平時(shí)隱藏在血小板膜糖蛋白GP Ⅱb/Ⅲa 人凝血因子IX中，由于GP Ⅱb/Ⅲa需要Ca2+存在下保持其異二聚體結(jié)構(gòu)，EDTA可以通過(guò)它與Ca2+的螯合作用分離GP Ⅱb/Ⅲa，導(dǎo)致GP IIb表簇的暴露[9-11]。但亦有報(bào)道證實(shí)在健康群體和各種不同疾病的病人身上都存在這些抗血小板自身抗體卻沒(méi)發(fā)生EDTA依賴性假性血小板減少癥[12]。已有文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)EDTA依賴性假性血小板減少癥血小板的CD41、CD61、CD62p、PAC-1 等活化指標(biāo)為研究基礎(chǔ)，對(duì)EDTA依賴性假性血小板減少癥發(fā)生機(jī)制作了初步探討[13]。許多報(bào)道證實(shí)血小板膜糖蛋白多態(tài)性與血栓性疾病的具相關(guān)性[14-16]，但對(duì)其與EDTA 依賴性血小板假性減少癥的探討還未明確。EDP發(fā)生機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展，主要集中在相關(guān)的免疫球蛋白方面的研究，但在基因水平的研究較少，為了獲得進(jìn)一步研究，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)，探討GPⅡb/Ⅲa基因多態(tài)性與EDTA 依賴性血小板假性減少癥的相關(guān)性關(guān)系。為進(jìn)一步闡明EDP 患者血小板聚集的遺傳機(jī)制，可更好的為臨床準(zhǔn)確診斷具有重要的臨床意義。

表1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅡbHPA-3基因型例數(shù)和百分比n(%)

基因型 A/AA/CC/C2P組別實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組9(31.0)14(48.3)6(20.7)3(14.3)11(52.4)7(33.3)2.2140.331

表2 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅢa HPA-6基因型百分比n(%)

表3 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅢa HPA-6基因后一位點(diǎn)基因型百分比 n(%)

表4 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組GPⅢa HPA-6基因下一位點(diǎn)雜合型與純合型百分比 n(%)

GPⅡb 和GPⅢa 基因均定位于染色體17q21—22，GPⅡb基因位于GPⅢa 基因的3′端，基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位于上游184～213 kb 區(qū)域。兩者相距不足260 kb。GPⅡb 基因含有29 個(gè)內(nèi)含子和30 個(gè)外顯子，基因全長(zhǎng)約17.2 kb[17]。編碼GPⅡb/Ⅲa的基因具有高度多態(tài)性的特點(diǎn)。血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa 基因可由于突變、缺失或插入導(dǎo)致表型改變，導(dǎo)致血小板膜GP Ⅱb/Ⅲa結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平發(fā)生變化，進(jìn)而影響血小板的黏附、聚集作用。目前已確認(rèn)常見(jiàn)抗原編碼的GP Ⅱb/Ⅲa 基因，如GP Ⅲa(HPA-1，-4，-6,-7，-8，-10)和GP Ⅱb(HPA-3，-9)。GP Ⅲa基因多態(tài)性最常見(jiàn)的是2號(hào)外顯子的T1565C，還包括C157T、G1846T、C1267G、G1996A、A1163C、C2004T、C12569T等。GP IIb基因多態(tài)性主要有HPA3a/3b，其他的多態(tài)性位點(diǎn)還包括MAX-/MAX+、GP IIb G1063A等。本研究對(duì)GPⅡb HPA-3和GPⅢa HPA-6基因多態(tài)性與EDTA 依賴性血小板假性減少癥的相關(guān)性進(jìn)行了探討。研究發(fā)現(xiàn)GPⅡbHPA-3基因多態(tài)性在實(shí)驗(yàn)組中A/A、A/C和C/C基因型頻率分別是31.0%、48.3% 和20.7%，對(duì)照組基因型頻率分別是14.3%、52.4%和 33.3%，兩組之間基因多態(tài)性頻率無(wú)顯著差異P>0.05。GPⅢa HPA-6基因多態(tài)性在實(shí)驗(yàn)組中C/C和G/G基因型頻率分別是6.9%和93.1%，對(duì)照組基因型頻率分別是19.0%和81.0%，兩組之間基因多態(tài)性分布無(wú)顯著差異P>0.05。GPⅢa HPA-6基因rs13306487位點(diǎn)后一位基因多態(tài)性在實(shí)驗(yàn)組中A/A、A/G和G/G基因型頻率分別是3.4%、55.2% 和41.4%，對(duì)照組基因型頻率分別是14.3%、23.8% 和61.9%，兩組之間基因多態(tài)性分布無(wú)顯著差異P>0.05。尚不能得出膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa HPA-3和 HPA-6多態(tài)位點(diǎn)與EDTA 依賴性血小板假性減少癥之間存在相關(guān)性。但在GPⅢa HPA-6rs13306487位點(diǎn)后一位純合子基因型(A/A和 G/G)與雜合子基因型A/G頻率分別是44.8%和55.2%，對(duì)照組分別是76.2%和23.8%，雜合基因型A/G在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間分布頻率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.027，P<0.05)，可初步推斷GPⅢa HPA-6位點(diǎn)后一位雜合基因型A/G與EDTA 依賴性血小板假性減少癥之間存在一定的相關(guān)性。也為后續(xù)研究EDTA 依賴性血小板假性減少癥聚集血小板解離奠定基礎(chǔ)。進(jìn)一步可有效避免誤診、誤治和醫(yī)療糾紛，使檢驗(yàn)工作在解決血小板假性減少問(wèn)題方面有新的突破。由于本研究標(biāo)本量比較小，相關(guān)研究結(jié)論仍需進(jìn)一步的大標(biāo)本研究證實(shí)。