李玉蕾，龍 隆，溫 泉，王莉莉，宮澤輝，蘇瑞斌

(軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所1.抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.神經(jīng)精神藥理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850)

大量研究表明，抑郁癥、焦慮癥、藥物成癮、精神分裂癥等精神疾病均與kappa阿片受體(kappa opioid receptor, KOR)系統(tǒng)相關(guān)[1-3]，KOR也因此成為相關(guān)新藥研發(fā)的一個(gè)重要靶標(biāo)，而建立KOR穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株則是快速高效地實(shí)現(xiàn)篩選靶向KOR配體的重要前提。通過對(duì)細(xì)胞群體的成像，高內(nèi)涵分析(high-content analysis, HCA)不僅能夠測量與疾病狀態(tài)密切相關(guān)的復(fù)雜表型結(jié)果，同時(shí)還可以在初篩時(shí)對(duì)藥物動(dòng)力學(xué)的某些方面進(jìn)行初步的細(xì)胞水平評(píng)估。此外，其在單個(gè)細(xì)胞水平上整合的多個(gè)參數(shù)的測量，可以促進(jìn)更復(fù)雜的任務(wù)分析方法，例如候選藥物的靶標(biāo)預(yù)測或?qū)ι^程中涉及的蛋白質(zhì)的精確鑒定[4-5]。本文利用高內(nèi)涵分析方法，建立了人kappa阿片受體(human kappa opioid receptor, hKOR)與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)標(biāo)記的蛋白激酶A催化亞基(catalytic domain of cAMP-dependent protein kinase A, PKAcat)融合蛋白(PKAcat-EGFP)穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株，并利用KOR的特異激動(dòng)劑U-50488對(duì)其進(jìn)行了初步功能鑒定。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與試劑穩(wěn)定表達(dá)PKAcat-EGFP的CHO細(xì)胞株(CHO-PKAcat-EGFP)由本研究所王莉莉教授提供。pcDNA3.1(+)-hKOR質(zhì)粒(UMR cDNA 資源中心)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生物技術(shù)公司)；去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(OMEGA)；pcDNA3.1/Hygro(+)質(zhì)粒、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、潮霉素B、Lipofectamine 2000、Hoechst 33342、HBSS(Life Technologies)；F12培養(yǎng)基(Hyclone)；G418(Merck)；(±)-trans-U-50488 methansulfonate salt(U-50488)、佛司可林(forskolin)、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX)，均購自Sigma Aldrich；LANCE cAMP 384 Kit、OptiPlate-384孔板(Perkin Elmer)。

1.2儀器EVOSf1熒光倒置顯微鏡(AMG公司)；EnVision 2104多功能酶標(biāo)儀(Perkin Elmer公司)；In Cell Analyzer 1000高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(GE healthcare life science公司)。

1.3pcDNA3.1/Hygro(+)-hKOR重組質(zhì)粒構(gòu)建將質(zhì)粒用HindⅢ、XbaⅠ限制性雙酶切消化，1%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，并切下 hKOR片段條帶。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收片段，并與同樣用HindⅢ、XbaⅠ限制性雙酶切消化，得到的pcDNA3.1/Hygro(+)載體片段以摩爾比1 ∶1連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α新鮮感受態(tài)細(xì)胞，用含氨芐青霉素LB平板篩選，菌落PCR鑒定陽性菌落。反應(yīng)結(jié)束后，取1～5號(hào)陽性菌落，并以pcDNA3.1/Hygro(+)載體為對(duì)照，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。將若干個(gè)單克隆分別接種于5 mL含氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。取菌液測序、比對(duì)，選擇序列比對(duì)結(jié)果正確的陽性克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞將細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度為70%～80%時(shí)，將pcDNA3.1/Hygro(+)和pcDNA3.1/Hygro(+)-hKOR質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。d 2傳至75 cm2培養(yǎng)瓶中，d 3用含200 mg·L-1潮霉素B、500 mg·L-1G418和10% FBS的F12培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

1.5有限稀釋法克隆化培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)10 d后消化細(xì)胞，按1 mL含5個(gè)細(xì)胞的密度稀釋，混勻后，以每孔0.2 mL的體積接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)4 d后，觀察克隆生長情況，并標(biāo)記只含1個(gè)細(xì)胞克隆的孔，繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后，消化細(xì)胞克隆，取部分接種至96孔黑色透底檢測板中，每個(gè)克隆3個(gè)孔，準(zhǔn)備進(jìn)行鑒定。

1.6PKA重分布實(shí)驗(yàn)鑒定陽性克隆每個(gè)克隆的3個(gè)孔分別為空白組、forskolin組和U-50488組。細(xì)胞接種d 2，每孔加入100 μL F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，棄液，每孔再加入100 μL的F12培養(yǎng)基。配制含4 μmol·L-1U-50488的F12培養(yǎng)基，加50 μL于U-50488組，其余兩組加50 μL F12培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min；孵育期間配制含40 μmol·L-1forskolin的F12培養(yǎng)基，各加50 μL于forskolin組和U-50488組，空白組加50 μL F12培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 min；孵育結(jié)束后，每孔加入100 μL 12%的甲醛溶液固定20 min，每孔加入200 μL PBS洗滌細(xì)胞3次。再每孔加入100 μL濃度為1 μmol·L-1的Hoechst 33342染核。利用In Cell Analyzer 1000獲取細(xì)胞熒光圖像，用多靶點(diǎn)分析模塊(multi target analysis, MTA)分析PKAcat-EGFP的重分布程度，計(jì)算顆粒形成指數(shù)(foci formation index, FFI)。FFI=(顆粒熒光強(qiáng)度-背景熒光強(qiáng)度)×顆粒熒光總面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用活性(Activity)表示。計(jì)算公式為：Activity/%=(U-50488組FFI-forskolin組FFI)/(空白組FFI-forskolin組FFI)×100%。

1.7U-50488誘導(dǎo)陽性克隆PKAcat-EGFP重分布CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞株與篩選出的CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13克隆細(xì)胞株接種于96孔黑色透底檢測板。d 2，每孔加入100 μL F12培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次，棄液，每孔再加入100 μL的F12培養(yǎng)基。兩種細(xì)胞株的U-50488組分別加入50 μL U-50488，使其終濃度為100 nmol·L-1，forskolin組分別加入50 μL F12培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。以上4組每孔各加入50 μL含40 μmol·L-1forskolin的F12培養(yǎng)基，使其終濃度為10 μmol·L-1，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育5 min。孵育結(jié)束后，每孔加入100 μL 12%的甲醛溶液固定20 min，每孔加入200 μL PBS洗滌細(xì)胞3次，每孔加入100 μL 1 μmol·L-1的Hoechst 33342染核。利用In Cell Analyzer 1000獲取細(xì)胞熒光圖像，MTA分析PKAcat-EGFP的重分布程度，計(jì)算FFI。

1.8CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13細(xì)胞模型可靠性評(píng)價(jià)采用Z’因子對(duì)建立的細(xì)胞模型進(jìn)行可靠性評(píng)價(jià)。Z’因子的計(jì)算公式：Z’=1-(3σC++3σC-)/︱μC+-μC-︱×100%。其中，σ為標(biāo)準(zhǔn)差；μ為平均值；C+為陽性對(duì)照；C-為陰性對(duì)照。細(xì)胞接種于96孔黑色透底檢測板，實(shí)驗(yàn)過程同“1.6”。利用In Cell Analyzer 1000獲取細(xì)胞熒光圖像，MTA分析PKAcat-EGFP的重分布程度，計(jì)算各組FFI與Z’因子。

1.9PKA重分布實(shí)驗(yàn)檢測CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13受體功能細(xì)胞接種于96孔黑色透底檢測板，分為空白組、forskolin組、U-50488組(1000.00、333.33、111.11、37.04、12.35、4.11、1.37、0.46、0.15、0.05 nmol·L-1)，每組4個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)過程與計(jì)算公式同“1.6”。

1.10LANCEcAMP384Kit驗(yàn)證CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13受體功能利用 LANCE cAMP 384 Kit檢測U-50488對(duì)胞內(nèi)cAMP濃度的影響。細(xì)胞接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿。d 2，細(xì)胞經(jīng)凡爾生溶液(Versene)消化后，用HBSS吹打細(xì)胞并重懸，1 000×g離心5 min，棄上清，加入適量刺激緩沖液(HBSS含5 mmol·L-1HEPES、0.1% BSA、0.5 mmol·L-1IBMX)重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1.2×109·L-1，在OptiPlate-384孔板中，空白組每孔加入5 μL刺激緩沖液，forskolin組每孔加入2.5 μL刺激緩沖液和2.5 μL 40 μmol·L-1forskolin，U-50488組每孔加入2.5 μL濃度為10 μmol·L-1U-50488和2.5 μL濃度為40 μmol·L-1forskolin，各組每孔加入5 μL細(xì)胞-抗體復(fù)合物，室溫孵育30 min后，每孔加入10 μL檢測復(fù)合物，混合后室溫孵育 4 h，EnVision 2104多功能酶標(biāo)儀測定發(fā)射波長665 nm的讀數(shù)。

2 結(jié)果

2.1構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)-hKOR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約400 bp處，1～5號(hào)陽性菌落均有目的條帶(Fig 1)，證明hKOR基因片段已正確插入到重組質(zhì)粒中，并特異表達(dá)。其中5號(hào)陽性菌落測序結(jié)果與PubMed上的hKOR DNA序列(No.U11053)進(jìn)行比對(duì)，除3個(gè)堿基外完全一致，分別為T36→G、G843→A、T846→C，根據(jù)密碼子的簡并性，突變并不影響所翻譯出的氨基酸種類。重組質(zhì)粒已正確構(gòu)建，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Fig 1 Colony PCR results of pcDNA3.1/Hygro(+)-hKORrecombinant plasmid

1～5: Positive colony of pcDNA3.1/Hygro(+)-hKOR; 6: Colony of pcDNA3.1/Hygro(+); M: DNA marker.

2.2篩選陽性克隆克隆化培養(yǎng)挑選出的76個(gè)單克隆，利用PKA重分布實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過3次篩選，選出平均活性較高，且細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化、生長狀態(tài)穩(wěn)定的13號(hào)克隆細(xì)胞株(CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(Fig 2)。

2.3U-50488誘導(dǎo)CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13細(xì)胞內(nèi)PKAcat-EGFP重分布如Fig 3所示，在100 nmol·L-1的U-50488作用下，與未表達(dá)hKOR的CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞相比，表達(dá)hKOR的CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13細(xì)胞中的PKAcat-EGFP發(fā)生了明顯的重分布現(xiàn)象。由于CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞無hKOR表達(dá)，因此不會(huì)對(duì)U-50488有反應(yīng)，僅對(duì)腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase, AC)激動(dòng)劑forskolin有反應(yīng)，最終表現(xiàn)為熒光顆粒減少。

Fig2CHO-PKAcat-EGFP/hKORclonescreeningbyPKAredistributionassayCell clones were treated with 1 μmol·L-1U-50488 for 30 min. A: The primary screening; B: The second screening; C: The third screening.

2.4CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13細(xì)胞模型可靠性評(píng)價(jià)Z’因子廣泛應(yīng)用于高通量篩選、高內(nèi)涵分析實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性的評(píng)價(jià)之中，1≥Z’≥0。Z’=0，說明該實(shí)驗(yàn)體系不成立；0.5>Z’>0，說明該實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定性差；當(dāng)1>Z’≥0.5，說明實(shí)驗(yàn)體系穩(wěn)定性好；當(dāng)Z’=1時(shí)，則表示一種理想的實(shí)驗(yàn)體系[6]。100 nmol·L-1的U-50488作用時(shí)的Z’平均值為0.596(Fig 4)，證明該細(xì)胞模型是穩(wěn)定可靠的。

Fig 4 Values of Z’ factor in three independent

2.5CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13表達(dá)hKOR穩(wěn)定性評(píng)價(jià)以該細(xì)胞克隆凍存后再復(fù)蘇的細(xì)胞作為第1代，經(jīng)反復(fù)傳代，在第5代及第30代，由PKA重分布實(shí)驗(yàn)得出的U-50488的EC50值接近(Fig 5)。表明細(xì)胞中的hKOR在30代以內(nèi)能穩(wěn)定表達(dá)，可滿足實(shí)驗(yàn)需求。

2.6U-50488對(duì)CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度的影響LANCE cAMP 384 Kit是一種均相時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移免疫分析。該測定基于銪標(biāo)記的cAMP示蹤劑復(fù)合物與樣品cAMP競爭AlexaFluor 647標(biāo)記的cAMP特異性抗體上的結(jié)合位點(diǎn)。通過生物素-cAMP(b-cAMP)和銪-W8044螯合物(Eu-SA)標(biāo)記的鏈霉親和素檢測銪標(biāo)記的cAMP示蹤劑復(fù)合物。當(dāng)抗體結(jié)合Eu-SA/b-cAMP示蹤劑時(shí)，340 nm激發(fā)光激發(fā)示蹤劑的Eu-SA分子，其發(fā)射的能量被轉(zhuǎn)移到抗體上的Alexa分子上，產(chǎn)生665 nm的發(fā)射光。測試樣品cAMP的存在導(dǎo)致665 nm處測量的熒光強(qiáng)度(fluorescence intensity,FI)降低，并且所得到的信號(hào)與樣品的cAMP濃度成反比。CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13細(xì)胞單獨(dú)給予10 μmol·L-1的forskolin刺激時(shí)，能夠升高cAMP濃度，表現(xiàn)為LANCE信號(hào)強(qiáng)度FI(665 nm)明顯降低，而同時(shí)給予10 μmol·L-1U-50488能夠明顯抑制這種cAMP的升高(Fig 6)。進(jìn)一步證明hKOR在該細(xì)胞株中已穩(wěn)定表達(dá)。

Fig 5 Concentration response curves of U-50488 in CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13 clone by PKA redistribution assay

Cells were treated with U-50488 for 30 min. A: Passage 5, the EC50value of U-50488 was approximately 2.37 nmol·L-1; B: Passage 30, the EC50value of U-50488 was approximately 8.47 nmol·L-1.

Fig 6 Effect of forskolin and U-50488 on cAMP concentrationin CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13

**P<0.01vsforskolin group

3 討論

近年來，將受體基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，使之在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，觀察表達(dá)的受體對(duì)相應(yīng)配體的敏感性和反應(yīng)性，已成為受體研究和新藥評(píng)篩的常用方法。利用該技術(shù)，將hKOR基因轉(zhuǎn)染到已穩(wěn)定表達(dá)PKAcat-EGFP的CHO細(xì)胞，得到hKOR與下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子PKA共表達(dá)的克隆細(xì)胞株，就可以非?？焖僦庇^地對(duì)hKOR進(jìn)行功能測定和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的研究。以往建立的KOR單轉(zhuǎn)細(xì)胞株陽性克隆的篩選方法無論是RT-PCR、Western blot，還是放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)等，都存在細(xì)胞用量大、過程繁瑣、實(shí)驗(yàn)周期長，因此常會(huì)延遲陰性克隆的去除，且篩選出的陽性克隆還需再進(jìn)行功能分析，投入的資金與精力較多。本文利用高內(nèi)涵分析方法建立的hKOR與PKAcat-EGFP共表達(dá)細(xì)胞株，對(duì)細(xì)胞內(nèi)熒光標(biāo)記的信號(hào)分子進(jìn)行轉(zhuǎn)位分析，在96孔板水平即可進(jìn)行陽性克隆的篩選，以及檢測配體對(duì)hKOR下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，其過程快速，結(jié)果直觀，能夠滿足靶向KOR配體的快速篩選要求。

由于CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞以G418為篩選標(biāo)記，與購買的pcDNA3.1(+)-hKOR質(zhì)粒的pcDNA3.1(+)載體抗性相同，若想在CHO細(xì)胞中共同穩(wěn)定表達(dá)這兩種外源基因，則需將hKOR基因克隆到含其他類型真核細(xì)胞篩選標(biāo)記的載體中。而潮霉素B適合與G418聯(lián)用，所以選擇將hKOR基因定向克隆至pcDNA3.1/Hygro(+)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)-hKOR。 U-50488是一種高選擇性KOR激動(dòng)劑，作為工具藥已被廣泛應(yīng)用于KOR相關(guān)實(shí)驗(yàn)[7]。本研究即利用U-50488進(jìn)行陽性細(xì)胞克隆的篩選及后續(xù)實(shí)驗(yàn)，且在不表達(dá)KOR的CHO-PKAcat-EGFP細(xì)胞株中，U-50488未表現(xiàn)出對(duì)PKAcat-EGFP重分布的影響。

對(duì)于表達(dá)受體功能的檢測，本研究采用了較為新穎的PKA重分布實(shí)驗(yàn)。PKA是一種在真核細(xì)胞中普遍存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在信息調(diào)控及細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中的地位非常重要[8]。胞內(nèi)cAMP濃度影響PKA活化，未處理細(xì)胞株中，cAMP濃度較低，PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)高亮度熒光顆粒聚集體；當(dāng)cAMP濃度升高時(shí)，PKAcat-EGFP會(huì)從聚集體中釋放出來，表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)熒光顆粒的減少。利用PKA 的這種重分布現(xiàn)象即可檢測化合物對(duì)受體功能的影響[9-10]。由于KOR為Gi偶聯(lián)GPCR，激活后抑制AC，阻礙ATP形成cAMP[11]，導(dǎo)致PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成顆粒，與未處理細(xì)胞表現(xiàn)一致。因此，需加入AC激動(dòng)劑forskolin[12]，升高細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度，使PKAcat-EGFP在細(xì)胞質(zhì)中呈彌散分布。

本研究建立的細(xì)胞模型——CHO-PKAcat-EGFP/hKOR-13，通過PKA重分布實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)的LANCE cAMP 384 Kit兩種實(shí)驗(yàn)均證明了其表達(dá)的hKOR具有活性，且經(jīng)反復(fù)傳代至30代其與U-50488的結(jié)合能力也基本不變，表明該細(xì)胞株構(gòu)建成功。該細(xì)胞模型所表達(dá)的hKOR與天然表達(dá)的受體相似，能夠與特定的胞內(nèi)信號(hào)分子偶聯(lián)，引起細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)，為考察hKOR的功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)行高通量的藥物篩選，篩選特異性更強(qiáng)的hKOR激動(dòng)劑，研發(fā)出更好、更有效的藥物建立了很好的平臺(tái)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究KOR激動(dòng)劑的藥理作用機(jī)制打下了基礎(chǔ)。