朱 晨，劉 偉，李 璟，李 嬋，房 淼，陳志杰，周玉婷，羅超華，莫志賢

(南方醫(yī)科大學(xué)1. 中醫(yī)藥學(xué)院中藥藥理學(xué)教研室、2. 中心實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510515)

鉤藤具有清熱平肝、息風(fēng)止痙的功效，是治療頭痛眩暈、驚癇抽搐、妊娠子癇等病證的常用中藥[1]。鉤藤主要含生物堿、黃酮、三萜類等，其中鉤藤堿含量約占總堿的34.5%～51.0%，為其主要有效成分，具有降血壓、鎮(zhèn)靜、抗血小板聚集和抗血栓形成的作用[2]。本團(tuán)隊(duì)初期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿具有抑制甲基苯丙胺(methamphetamine, METH)引起的條件性位置偏愛(conditioned place preference，CPP)的作用。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)是多巴胺合成的限速酶，它是控制運(yùn)動(dòng)和獎(jiǎng)勵(lì)相關(guān)行為的重要物質(zhì)[3-4]。本文旨在探索鉤藤堿對METH誘導(dǎo)的小鼠CPP的作用，應(yīng)用蛋白免疫印跡和免疫組化法檢測TH的表達(dá)，進(jìn)一步闡明鉤藤堿對METH依賴小鼠CPP的分子作用機(jī)制。

1 材料

1.1藥品與試劑鹽酸甲基苯丙胺，購自國家麻醉品實(shí)驗(yàn)室，批號：1212-9802；鉤藤堿，購自日本MATSUURA YKUGYO 公司；鹽酸氯胺酮注射液(規(guī)格：2 mL:0.1 g)，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)；三卡因甲磺酸鹽(MS222)，購自Sigma公司; 抗TH抗體(AB152)，購自Millipore公司。

1.2儀器Noldus EthoVision XT 8.5軟件(荷蘭Noldus公司)；ChemiImager 550凝膠成像儀(美國Alpha Innotech公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，♀♂各半，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2011-0015。

2 方法

2.1CPP箱的制作CPP箱由兩個(gè)長15 cm，寬15 cm，高15 cm的箱體組成，其中一箱體涂成黑色，另一箱體涂成白色；兩箱體之間由一透明活動(dòng)擋板分隔開，當(dāng)透明擋板抽開時(shí)，小鼠可在兩箱體間自由活動(dòng)[5]。

2.2小鼠基線測定實(shí)驗(yàn)前，將小鼠放于抽出擋板的CPP箱中，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，進(jìn)行小鼠位置偏愛測試。測試前將擋板抽出，小鼠放置于兩箱體中間，記錄小鼠在15 min內(nèi)在黑白箱中的活動(dòng)時(shí)間(以頭部為準(zhǔn))。結(jié)果表明，自然狀態(tài)下，>90%的小鼠偏愛黑箱，因此，將黑箱選為偏愛箱，白箱選為伴藥箱。小鼠篩選以在黑箱中的活動(dòng)時(shí)間>8 min為合格。

2.3CPP模型的復(fù)制與給藥取基線測定合格的小鼠50只，隨機(jī)分成5組，分別為：空白對照組、模型組、鉤藤堿低劑量組(40 mg·kg-1)、鉤藤堿高劑量組(80 mg·kg-1)、氯胺酮組(15 mg·kg-1)。d 1,記錄小鼠15 min內(nèi)在CPP箱中的活動(dòng)。d 2～5，模型組和給藥組每天上午8 ∶00皮下注射METH 4 mg·kg-1(對照組注射同體積生理鹽水)，之后放入伴藥箱中訓(xùn)練1 h；鉤藤堿組從d 3開始，在注射METH前30 min，灌胃相應(yīng)劑量的鉤藤堿；氯胺酮組從d 3開始，在注射METH之前15 min，腹腔注射氯胺酮(15 mg·kg-1)；各組下午4 ∶00給予生理鹽水(0.15 mL，sc)后，放入黑箱中訓(xùn)練1 h，連續(xù)4 d。d 6即末次給藥24 h后，記錄各組小鼠在CPP箱中15 min 內(nèi)的活動(dòng)。

2.4免疫組化法檢測小鼠海馬區(qū)TH的表達(dá)行為學(xué)測定完成后，處死小鼠，取腦組織，于4%多聚甲醛中固定24 h。腦組織進(jìn)行常規(guī)脫水、包埋、切片，厚度約5 μm,用防脫載玻片撈起，進(jìn)行常規(guī)脫蠟和水化。按常規(guī)免疫組化法進(jìn)行TH免疫組化染色，一抗為TH(1 ∶100)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶200)，陰性對照則用PBS液代替一抗。結(jié)果判定陽性表達(dá)為胞膜和(或)胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色顆粒染色，若無棕黃色顆粒則為陰性。

2.5Westernblot檢測TH的表達(dá)行為學(xué)測定結(jié)束后，將小鼠處死，取出小鼠的腦組織，加入RIPA裂解液和PMSF(50 ∶1)，進(jìn)行超聲勻漿提取組織蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，參考之前的文獻(xiàn)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。一抗為TH(1 ∶100)，以β-actin為內(nèi)標(biāo)；二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶1 000)。用ChemiImager 550凝膠成像儀采集圖像，并用Image-Pro Plus 6.0軟件分析每個(gè)條帶的積分光密度(IOD)值。

3 結(jié)果

3.1小鼠訓(xùn)練前后在伴藥箱的活動(dòng)時(shí)間變化用Noldus EthoVision XT8.5軟件，分析訓(xùn)練前后小鼠在伴藥箱中的停留時(shí)間和運(yùn)動(dòng)軌跡，比較訓(xùn)練前后各組小鼠在伴藥箱中活動(dòng)時(shí)間的差值(小鼠訓(xùn)練后在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間-小鼠訓(xùn)練前在伴藥箱中的活動(dòng)時(shí)間)。由Tab 1可見，與空白組相比，注射METH 4 mg·kg-1后，模型組小鼠在伴藥箱中停留時(shí)間明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組小鼠在伴藥箱中的停留時(shí)間明顯減少(P<0.01)。各組小鼠造模前后在CPP箱的運(yùn)動(dòng)路線圖見Fig 1。

3.2TH蛋白免疫組化結(jié)果采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測定陽性細(xì)胞的IOD值，取其平 均值作為該組各項(xiàng)指標(biāo)的相對含量。如Fig 2所示，

Tab 1 Change of activity time of mice in non-preferred compartment by injection of methamphetamine

**P<0.01vscontrol group;##<0.01vsmodel group

Fig 1 Road maps of mice in CPP compartment

A: Control group before modeling; B: Control group after modeling; C: Methamphetamine model group before modeling; D: Methamphetamine model group after modeling; E: Rhynchophylline low-dose group before modeling; F: Rhynchophylline low-dose group after modeling; G: Rhynchophylline high-dose group before modeling; H: Rhynchophylline high-dose group after modeling; I: Ketamine group before modeling; J: Ketamine group after modeling.

與對照組相比，經(jīng)過CPP訓(xùn)練后，模型組小鼠海馬區(qū)中TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，給予鉤藤堿干預(yù)后，小鼠海馬區(qū)TH陽性細(xì)胞數(shù)明顯下降(P<0.01)。

3.3TH蛋白的westernblot分析結(jié)果如Fig 3所示，小鼠腦內(nèi)的TH表達(dá)IOD值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對照組相比，模型組小鼠腦內(nèi)的TH表達(dá)增加(P<0.01)；與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組小鼠腦內(nèi)的TH表達(dá)明顯減少(P<0.01)。

Fig 2 Micrographs of TH positive cells in hippocampus of mice n=10)

1: Control group; 2: Model group of methamphetamine; 3: Low-dose of rhynchophylline group; 4: High-dose of rhynchophylline group; 5: Ketamine group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

Fig 3 Expression of TH of mice by western n=3)

1: Control group; 2: Model group of methamphetamine; 3: Low-dose of rhynchophylline group; 4: High-dose of rhynchophylline group; 5: Ketamine group.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

4 討論

METH為白色透明不規(guī)則晶體，俗稱“冰毒”，1919年由日本科學(xué)家首次合成，其特點(diǎn)為見效快、藥效持續(xù)時(shí)間長。國家禁毒辦公布的《2017年中國禁毒報(bào)告》顯示，2016年繳獲各類毒品82.1噸，其中冰毒晶體17.4噸，位于榜首。METH有很強(qiáng)的中樞興奮作用，極易成癮，且復(fù)吸率高。

CPP實(shí)驗(yàn)是一種常用的藥物獎(jiǎng)賞效應(yīng)以及藥物渴求研究的動(dòng)物模型，是評估藥物依賴精神依賴性最方便、最常用、最經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)。人為地將藥物與動(dòng)物先天的非偏愛側(cè)相聯(lián)系，通過對比動(dòng)物在非偏愛側(cè)停留時(shí)間的長短，判斷藥物精神依賴性的強(qiáng)弱[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，給予METH 4 mg·kg-1后，模型組小鼠在伴藥箱中的時(shí)間明顯增加，說明注射METH 4 mg·kg-1可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生CPP效應(yīng)。與模型組相比，鉤藤堿低、高劑量組(40、80 mg·kg-1)小鼠在伴藥箱中的逗留時(shí)間明顯減少，表明低、高劑量鉤藤堿對METH依賴小鼠CPP具有一定的抑制作用。

藥物成癮的機(jī)制十分復(fù)雜，與腦內(nèi)多種蛋白質(zhì)表達(dá)和結(jié)構(gòu)功能改變有關(guān)。 TH在兒茶酚胺生物合成過程中至關(guān)重要，是其中最重要的關(guān)鍵酶，同時(shí)也是多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記酶，與藥物依賴獎(jiǎng)賞通路密切相關(guān)。研究表明，與正常組相比，給予苯丙胺50 mg·kg-1,可使斑馬魚端腦區(qū)TH mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)[7];斑馬魚腹腔注射40 mg·kg-1METH 3次后，其腦內(nèi)TH蛋白的表達(dá)明顯增加[8]。腹腔注射METH(2.5、10 mg·kg-1)7 d后，小鼠紋狀體中TH蛋白的表達(dá)，以及黑質(zhì)TH基因表達(dá)水平和TH陽性神經(jīng)元數(shù)量減少[9]。將TH-GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚(頭部熒光)浸泡在濃度為0.6 mg·L-1METH中，轉(zhuǎn)基因斑馬魚頭部熒光明顯增強(qiáng)[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對照組比較，給予METH 4 mg·kg-1后，METH依賴小鼠腦內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù)及TH蛋白的表達(dá)明顯增加；給予鉤藤堿干預(yù)后，小鼠腦內(nèi)TH陽性細(xì)胞數(shù)和TH蛋白表達(dá)明顯減少，表明TH與鉤藤堿抑制METH引起的CPP效應(yīng)有關(guān)，是動(dòng)物行為學(xué)改變的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制之一。

鉤藤堿是中藥鉤藤的主要活性成分，本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿能抑制苯丙胺類物質(zhì)誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生CPP，抑制苯丙胺所致大鼠腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化和大鼠伏隔核、杏仁核中NR2B蛋白表達(dá)的變化[11-12]。鉤藤堿可抑制METH引起的大鼠伏隔核內(nèi)GluR2/3亞基蛋白表達(dá)上調(diào)，以及下丘腦內(nèi)GluR2/3亞基蛋白表達(dá)下調(diào)[13]。鉤藤堿(60 mg·kg-1)可抑制METH依賴大鼠海馬CA1區(qū)和紋狀體中p-CREB、c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加的趨勢，使p-CREB及c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)恢復(fù)正常[14]。

本研究表明，鉤藤堿具有抑制METH依賴小鼠CPP的作用，這種作用可能與降低小鼠腦內(nèi)TH蛋白的表達(dá)有關(guān)。由于藥物成癮的發(fā)生與發(fā)展極其復(fù)雜，關(guān)于鉤藤堿調(diào)控TH的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。