閆文帝，李珍玲，劉特思，李玉姬，原田憲一，任香善,2

(延邊大學(xué)1. 腫瘤研究中心、2. 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 延邊 133002；3. 金澤大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理學(xué)教研室，日本 金澤 9208640)

Caroli病是一種常染色體隱性遺傳性多囊腎疾病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)的肝膽管病變，主要表現(xiàn)為肝內(nèi)膽管的擴(kuò)張，常合并門脈高壓及膽道炎癥[1]。目前，其治療手段主要為對(duì)癥治療或肝移植，尚無(wú)有效的治療方案[2]。多囊腎(polycystic kidney，PCK)大鼠為Caroli病和ARPKD的常用動(dòng)物模型，是目前為止唯一能夠充分反映多發(fā)性膽管囊腫和肝纖維化的動(dòng)物模型。

PI3K/Akt/mTOR是可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的信號(hào)通路。研究表明，在乳腺癌、胃癌、肺癌等多種癌癥中異?；罨痆3-4]。雷帕霉素是經(jīng)典的mTOR抑制劑，是mTORC1的變構(gòu)抑制劑，對(duì)多種腫瘤有抑制作用[5]。PP242可同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2，減少負(fù)反饋導(dǎo)致的耐藥問(wèn)題[6]。研究證實(shí)，PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中p-Akt、p-mTOR、p-S6等蛋白在ARPKD中呈高表達(dá)[7]，提示Akt/mTOR信號(hào)通路與ARPKD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。目前為止，尚無(wú)PP242對(duì)Caroli病的研究報(bào)道。本研究旨在闡明mTOR的雙重抑制劑PP242對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響，進(jìn)一步探究其機(jī)制，為Caroli病的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料

1.1細(xì)胞及組織標(biāo)本正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞以及肝組織蠟塊標(biāo)本均由日本金澤大學(xué)病理學(xué)教研室提供。

1.2試劑雷帕霉素、PP242購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA) 購(gòu)自Calbiochem公司，用DMSO配制濃縮液，分裝保存于-20℃冰箱；Alexa-488熒光二抗及p-mTOR、p-Akt、Akt、p-4EBP1、4EBP1、LC3、Rictor、Beclin-1抗體，均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；ssDNA ELISA 凋亡試劑盒購(gòu)自Millipore公司。

1.3儀器激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(日本Bay Bioscience公司)；EnVision+system(丹麥DakoCytomation公司)；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

2 方法

2.1PCK模型的制備與分組PCK大鼠是Crj:CD(SD)大鼠的PKHD1基因自發(fā)突變而來(lái)的動(dòng)物模型，由日本查爾斯河實(shí)驗(yàn)室的Katsuyama等[8]首次報(bào)道。2001年，日本金澤大學(xué)人體病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室Sanzen等首次提出PCK大鼠可作為ARPKD，特別是伴有先天性肝纖維化(congenital hepatic fibrosis，CHF)的Caroli病的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。本實(shí)驗(yàn)中使用的正常SD大鼠和PCK大鼠，均購(gòu)自于日本查爾斯河實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)原則均按照日本金澤大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南進(jìn)行。

2.2大鼠膽管上皮細(xì)胞的分離與肝組織標(biāo)本的制備膽管上皮細(xì)胞的分離方法如Sato等所述[9]，取8周齡的正常SD大鼠和PCK大鼠，用不含鈣和鎂的平衡鹽溶液沖洗門靜脈，再向門靜脈內(nèi)灌注含有0.04%膠原酶和0.22%分散酶的DMEM/F-12培養(yǎng)液靜置20 min，待正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞分離后，置于含10%胎牛血清、5 μmol·L-1毛喉素、20 μmol·L-1表皮生長(zhǎng)因子和1%青-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取10月齡正常和PCK大鼠的肝組織，4%甲醛緩沖液(pH 7.4)浸泡固定，石蠟包埋處理，將蠟塊切成4 μm厚切片，備免疫組化染色用。

2.3免疫組織化學(xué)染色采用EnVision法，大鼠組織切片常規(guī)脫蠟及水化，梯度乙醇入水，抗原修復(fù)用10 nmoL·L-1枸櫞酸鹽檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)微波加熱20 min，p-mTOR(Ser2448)(1 ∶200)和p-Akt(1 ∶25)一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育30 min，二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色1～10 min，蘇木精染核1 min，中性樹脂封片。

2.4WST-1比色法PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞經(jīng)雷帕霉素(0、0.1、0.5、2 mg·L-1)和PP242(0、0.1、0.5、2 μmol·L-1)處理24、72、120 h后，用WST-1比色法測(cè)定。500 nmol·L-13-MA預(yù)處理PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞1 h后，與2 μmol·L-1PP242聯(lián)合處理24 h，檢測(cè)PP242處理后對(duì)膽管上皮細(xì)胞增殖的影響。

2.5AnnexinV/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡將細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)到70%左右時(shí)，用藥組用藥處理24 h，陽(yáng)性對(duì)照組加入200 μmol·L-1的H2O2處理24 h后，常規(guī)消化收集細(xì)胞，進(jìn)行Annexin V-FITC和PI染色，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

2.6免疫蛋白印跡實(shí)驗(yàn)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞用PP242(0、0.1、0.5、2 μmol·L-1)處理24 h，提取細(xì)胞總蛋白，加入蛋白裂解液(T-PER)。蛋白定量后，將40 μg蛋白經(jīng)梯度膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，Akt (1 ∶1 000)、p-Akt (1 ∶1 000)、4EBP1(1 ∶1 000)、p-4EBP1 (1 ∶1 000)、LC3 (1 ∶500)、Rictor (1 ∶1 000)和Beclin-1 (1 ∶500) 4℃孵育過(guò)夜，加HRP標(biāo)記二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色，ChemiDOC成像系統(tǒng)拍照，Image J軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

2.7免疫熒光染色細(xì)胞接種于8孔細(xì)胞培養(yǎng)玻片，2 μmol·L-1PP242處理24 h，用4%多聚甲醛固定，用0.1%的Triton X-100處理10 min，血清封閉，LC3抗體(1 ∶200)4℃孵育過(guò)夜，DAPI染細(xì)胞核，封片后拍照觀察。

2.8LC3、Rictor和Beclin-1基因沉默實(shí)驗(yàn)LC3、Rictor和Beclin-1的siRNA 和陰性對(duì)照均購(gòu)自Qiagen公司，干擾序列見Tab 1。siRNA轉(zhuǎn)染使用HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，更換成DMEM/F-12培養(yǎng)液、siRNA (10 nmol·L-1)和3 μL HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑液的混合液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

Tab 1 Interference sequences of LC3, Beclin-1 and Rictor

2.9ELISA檢測(cè)ssDNAELISA實(shí)驗(yàn)是根據(jù)甲酰胺對(duì)凋亡細(xì)胞的感受性，選擇性地定量檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的單鏈DNA(single-strand DNA,ssDNA)的檢測(cè)方法。PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞用2 μmol·L-1的PP242處理24 h后，收集細(xì)胞上清液，離心后，將樣本按1 ∶100稀釋，微孔加入樣本處理30 min，酶標(biāo)記抗人IgG抗體處理30 min，加入底物顯色劑15 min(避光)，加入終止液后，用全波長(zhǎng)分光光度儀在450 nm處檢測(cè)吸光值，統(tǒng)計(jì)分析，以大于0.1 IU·L-1為陽(yáng)性。

2.103D細(xì)胞培養(yǎng)將細(xì)胞混懸于Matrigel中，細(xì)胞均勻接種到24孔板中，待Matrigel凝固后，加入常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)至d 6，更換含有100 nmol·L-1雷帕霉素和2 μmol·L-1PP242的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，換液后d 0、3，每個(gè)視野選擇3～5個(gè)細(xì)胞球拍照記錄，并用Image J分別測(cè)量d 0、3同一細(xì)胞球的直徑，計(jì)算增殖率：增殖率/%=(d 3直徑-d 0直徑)×100%。

3 結(jié)果

3.1p-mTOR和p-Akt蛋白在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中呈高表達(dá)Fig 1大鼠肝組織免疫組化染色結(jié)果顯示，p-mTOR和p-Akt蛋白在正常大鼠膽管上皮細(xì)胞中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。p-mTOR蛋白陽(yáng)性顆粒主要位于肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，而p-Akt 蛋白主要位于肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核。

3.2雷帕霉素和PP242對(duì)膽管上皮細(xì)胞增殖的影響正常和PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞分別用0、0.1、0.5、2 mg·L-1的雷帕霉素和0、0.1、0.5、2 μmol·L-1的PP242處理24、72、120 h后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，雷帕霉素和PP242藥物處理后的膽管上皮細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且呈濃度依賴性(P<0.05)。在同一時(shí)間、同一濃度下，PP242比雷帕霉素的抗增殖效果更明顯(Fig 2A、2B)。

Fig 1 Expression of p-mTOR and p-Akt in bile duct epithelial cells examined by immunohistochemistry (×200)

3.3雷帕霉素和PP242下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)不同濃度的雷帕霉素和PP242處理PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h后，p-Akt和p-4EBP1的蛋白表達(dá)水平隨著藥物濃度的增高而降低，且在2 μmol·L-1時(shí)抑制效果最為明顯。在相同濃度作用下，PP242對(duì)磷酸化Akt和4EBP1的抑制效果更明顯(Fig 2C、2D)。

3.4PP242誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，PP242組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(Fig 3A)。ssDNA ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PP242組細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(Fig 3B)。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，cleaved caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)(Fig 3C)。以上結(jié)果提示，PP242可誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞凋亡。

3.5PP242誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，0、0.1、0.5、1、2 μmol·L-1PP242作用于PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞24 h后，隨著藥物濃度的增加，自噬標(biāo)識(shí)蛋白LC3-II/ LC3-I的比值以及Beclin-1呈逐漸升高的趨勢(shì)，表明PP242能誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞發(fā)生自噬，且呈濃度依賴性(Fig 3D)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，2 μmol·L-1PP242處理組細(xì)胞胞質(zhì)中LC3綠色熒光顆粒含量明顯增多，熒光強(qiáng)度也明顯增強(qiáng)(Fig 3E)。

Fig 2 Effect of rapamycin and PP242 on viability of bile duct epithelial cells and protein level of PI3K/Akt/mTOR signal pathway n=3 )

A, B: The effect of rapamycin (mg·L-1) and PP242 (μmol·L-1) on proliferation in bile duct epithelial cells detected by WST-1 assay;*P<0.05vs24 h control;#P<0.05vs72 h control;△P<0.05vs120 h control. C，D: The effect of rapamycin and PP242 on the levels of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related proteins in the PCK rat cholangiocytes detected by Western blot.*P<0.05vscontrol.

3.6mTOR抑制劑抑制PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞成球能力3D細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，PP242組在處理72 h后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞成球能力明顯受到抑制(Fig 4A、4B)。蛋白印跡結(jié)果顯示，Rictor基因沉默后其蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)(Fig 4D)。為進(jìn)一步探尋mTORC2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，使用小干擾RNA處理mTORC2復(fù)合物Rictor，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rictor基因沉默對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞成球能力并未產(chǎn)生明顯影響，但當(dāng)與雷帕霉素聯(lián)合作用時(shí)，細(xì)胞的成球能力明顯受到抑制(Fig 4C、4E)。提示mTORC1和mTORC2共同抑制可明顯降低PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的成球能力，mTORC1/C2抑制劑PP242可明顯抑制膽管上皮細(xì)胞的增殖。

3.7LC3、Beclin-1siRNA和3-MA可逆轉(zhuǎn)PP242對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)為了觀察PP242抑制膽管上皮細(xì)胞增殖過(guò)程中自噬的作用，使用LC3和Beclin-1基因沉默方法及自噬抑制劑3-MA后，檢測(cè)PP242對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞增殖的影響。LC3基因沉默效果用免疫熒光染色方法鑒定，結(jié)果顯示，LC3基因沉默后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的綠色熒光顆粒明顯減少(Fig 5A)。Beclin-1基因沉默后，用蛋白印跡方法鑒定，結(jié)果顯示，Beclin-1基因沉默后其表達(dá)明顯下調(diào)(Fig 5B)。

LC3和Beclin-1 siRNA對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞活力的影響甚微，而與PP242共同處理可明顯增加細(xì)胞增殖活力(P<0.05)，見Fig 5C、5D。單獨(dú)使用0.5 μmol·L-13-MA時(shí)，對(duì)大鼠膽管上皮細(xì)胞活力的影響甚微，但3-MA與PP242共同處理后，減弱PP242對(duì)細(xì)胞活力的抑制效果(P<0.05)，見Fig 5E。上述結(jié)果提示，PP242誘導(dǎo)的自噬是抑制PCK膽管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一。

Fig 3 Effect of PP242 on apoptosis and autophagy of PCK rat cholangiocytes

A: The effect of PP242 (μmol·L-1) on apoptosis detected by Annexin V/PI double staining; B: The effect of PP242 on apoptosis detected by ELISA; C: The expression of cleaved caspase-3 increased in the PCK rat cholangiocytes treated with PP242; D: The bile duct epithelial cells treated with different concentrations of PP242 and rapamycin (mg·L-1) for 24 h, the level of Beclin-1 and the ratio of LC3-II/LC3-I increased; E: The protein expression of LC3 increased in PCK rat cholangiocytes treated with PP242 (immunofluorescence staining, ×400).*P<0.05vscontrol.

4 討論

Caroli病，即先天性肝內(nèi)膽管擴(kuò)張癥，其病因不明，在病情進(jìn)展中出現(xiàn)多種并發(fā)癥，且7%左右的患者可發(fā)展為膽管癌[10]，目前臨床上尚無(wú)有效的治療方案。PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路是與細(xì)胞增殖、凋亡和自噬相關(guān)的信號(hào)通路[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)水平在PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞中明顯增高，提示Akt/mTOR信號(hào)通路的異?；罨菍?dǎo)致PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)的機(jī)制之一。

雷帕霉素是一種對(duì)mTORC1有效的mTOR抑制劑，但對(duì)mTORC2不敏感。當(dāng)使用雷帕霉素時(shí)，mTORC2磷酸化Akt 473位點(diǎn)，負(fù)反饋激活PI3K/Akt/mTOR通路，導(dǎo)致部分患者在應(yīng)用雷帕霉素?cái)?shù)月后發(fā)生復(fù)發(fā)和耐藥，使雷帕霉素在臨床的應(yīng)用受到限制[12]。PP242是一種ATP競(jìng)爭(zhēng)性mTORC1/2雙重抑制劑，其主要靶點(diǎn)是mTORC2，可同時(shí)抑制mTORC1和mTORC2。Qin等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PP242可通過(guò)誘導(dǎo)凋亡和自噬抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)，PP242和雷帕霉素兩者均可抑制PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的增殖，且呈時(shí)間-濃度依賴性，其機(jī)制是下調(diào)PI3K/Akt/mTOR下游蛋白p-Akt和p-4EBP1的表達(dá)。而同等濃度下，PP242的抑制效果明顯強(qiáng)于雷帕霉素。在PP242處理膽管上皮細(xì)胞后，其成球能力明顯減弱。我們研究發(fā)現(xiàn)，單用雷帕霉素對(duì)細(xì)胞成球能力影響甚微，而Rictor基因沉默與雷帕霉素聯(lián)用后，細(xì)胞成球能力明顯受到抑制。提示mTORC1和mTORC2的共同抑制與mTORC1單獨(dú)抑制相比，其抑制膽管上皮細(xì)胞增殖的能力更明顯。

Fig 4 Effect of PP242 and Rictor gene silencing and rapamycin on ability of cell formation(×400)

A, B: The effects of rapamycin(100 nmol·L-1), Rictor siRNA and with rapamycin on bile duct epithelial cells spheroid formation examined for PCK cholangiocytes using three-dimensional cell culture system, PP242(2 μmol·L-1) significantly inhibited cystic growth of PCK cholangiocytes; C, E: Knockdown of Rictor with siRNA of PCK cholangiocytes treated with rapamycin significantly decreased the bile duct epithelial cells spheroid formation. D: The results of Western blot showed the silencing of Rictor for 72 h.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05vsRictor siRNA.

Qu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，PP242可誘導(dǎo)急性骨髓性白血病小鼠的白血病細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，PP242處理后，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，凋亡相關(guān)蛋白clevead caspase-3的表達(dá)隨著藥物濃度的升高而升高。提示PP242可誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞的凋亡。

Jin等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，LC3-I與磷脂酰乙醇胺共價(jià)結(jié)合后轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-II，進(jìn)一步結(jié)合在自噬體膜上，因此，當(dāng)LC3-II/LC3-I比值增高時(shí)說(shuō)明細(xì)胞產(chǎn)生了自噬。本研究發(fā)現(xiàn)，PP242處理后，LC3-II/LC3-I的比值增高，細(xì)胞內(nèi)LC3綠色免疫熒光顆粒表達(dá)增多，提示PP242處理后可誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬。為了進(jìn)一步探討PP242誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞自噬的機(jī)制，我們觀察了LC3、Beclin-1基因沉默和自噬抑制劑3-MA對(duì)細(xì)胞增殖活力的影響。研究發(fā)現(xiàn)，LC3、Beclin-1基因沉默和3-MA本身對(duì)細(xì)胞增殖影響甚微，但其與PP242聯(lián)用后，可明顯逆轉(zhuǎn)PP242對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，提示誘導(dǎo)細(xì)胞自噬是其抑制膽管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一。提示PP242可誘導(dǎo)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，其機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞自噬相關(guān)。

綜上所述，與單獨(dú)雷帕霉素相比，mTORC1/2抑制劑PP242對(duì)PCK大鼠膽管上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果更明顯，其機(jī)制與誘導(dǎo)凋亡和自噬相關(guān)。提示PP242有望成為Caroli病的治療藥物，并有待更進(jìn)一步的探究。

Fig 5 Effects of LC3 siRNA, Beclin-1 siRNA and 3-MA on proliferation of PCK rat cholangiocytes inhibited by PP242

A: The results of immunofluorescence showed the silencing of LC3 for 72 h; B: The results of Western blot showed the silencing of Beclin-1 for 72 h; C, D: The effect of LC3 siRNA or Beclin-1 siRNA for 72 h and PP242 (μmol·L-1) for 48 h together on the proliferation of the cholangiocytes detected by WST-1 assay.*P<0.05,**P<0.01vsnegative siRNA and PP242; E: The effect of 3-MA (500 nmol·L-1) and PP242 together for 48 h on the proliferation of cholangiocytes detected by WST-1 assay.#P<0.05vsPP242.