胡志輝， 陳禪友

[江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430056]

辣椒(CapsicumannuumL.)現(xiàn)已成為中國的重要蔬菜和調(diào)味品，生產(chǎn)上迫切需要一些優(yōu)質(zhì)、抗病、高產(chǎn)的優(yōu)良品種，加強(qiáng)辣椒種質(zhì)資源的親緣關(guān)系研究，掌握種質(zhì)資源的分類地位和親緣關(guān)系是辣椒品種選育上一個新臺階的重要途徑[1]。種子貯藏蛋白質(zhì)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，簡稱SDS-PAGE)成為研究小麥、蕓薹屬、扁蓿豆、菜豆等植物親緣關(guān)系的有效手段[2-5]，而辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性研究報道較少[6-12]。本試驗(yàn)運(yùn)用SDS-PAGE技術(shù)分析辣椒種子貯藏蛋白亞基構(gòu)成，研究辣椒種質(zhì)資源的遺傳多態(tài)性，確定辣椒3個主栽變種12個品種之間的親緣關(guān)系，為辣椒新品種選育工作的開展提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料均為成熟的辣椒種子(表1)，由湖北省豆類(蔬菜)植物工程技術(shù)研究中心提供。

表1 供試?yán)苯菲贩N名稱、來源及主要特征特性

1.2 種子貯藏蛋白的提取及電泳

參照胡志輝等的方法[13-14]提取辣椒種子貯藏蛋白并采用SDS-PAGE技術(shù)進(jìn)行電泳。辣椒種子貯藏蛋白提取緩沖液為丙三醇(甘油)5 mL+SDS 1 g+溴酚藍(lán)0.1 g+巰基乙醇2.5 mL，分別用0.2 mL蒸餾水、5%氯化鈉溶液、70%乙醇、0.2% NaOH提取上清液，即為水溶蛋白提取液(代號W)、鹽溶蛋白提取液(代號S)、醇溶蛋白提取液(代號P)、堿溶蛋白提取液(代號A)。SDS-PAGE分離膠T=12.5%，4 ℃左右條件下15 mA恒流電泳，點(diǎn)樣量18 μL，時間約8 h。每個樣品重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用“0，1”系統(tǒng)記錄蛋白譜帶，構(gòu)建蛋白譜帶數(shù)據(jù)庫。品種間蛋白質(zhì)圖譜相似系數(shù)S[15]及品種間遺傳距離GD[16]計(jì)算公式分別為

S=(品種間共有的條帶數(shù))/(2個品種中最多的條帶數(shù))；

GD=1-(2nxy)/(nx+ny)。

式中：nxy是2個品種間共有的條帶數(shù)；nx、ny分別是品種x、y的總條帶數(shù)。采用系統(tǒng)聚類最短距離法對12個辣椒品種進(jìn)行聚類分析[17]，繪制聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)電泳檢測

由圖1、表2可知，12個辣椒品種種子貯藏蛋白質(zhì)經(jīng) SDS-PAGE分析未檢測到醇溶蛋白，水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白共檢測出25條蛋白質(zhì)亞基帶，有23條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為92%，蛋白質(zhì)亞基分子量分布范圍是10 093～96 232 bp，蛋白質(zhì)亞基出現(xiàn)頻率變化幅度為0.08～1.00；點(diǎn)位帶編碼按分子量順序排列，堿溶蛋白、鹽溶蛋白、水溶蛋白分別檢出14、18、19條點(diǎn)位帶，其中有9條點(diǎn)位帶為3種貯藏蛋白所共有，第1、4、6點(diǎn)位帶為堿溶蛋白所特有，第22點(diǎn)位帶為鹽溶蛋白所特有，第20、21、23點(diǎn)位帶為水溶蛋白所特有；蛋白質(zhì)亞基分子量分別為43 668 bp的第9位點(diǎn)、26 605 bp 的第16位點(diǎn)的點(diǎn)位帶在所有品種中都出現(xiàn)，是辣椒品種共同的種子貯藏蛋白質(zhì)，其他出現(xiàn)頻度較高的點(diǎn)位帶有簇生椒類品種美國加州干椒王(編號5)缺少的第12點(diǎn)位帶、長椒類品種楚風(fēng)辣椒(編號8)缺少的第10點(diǎn)位帶、華椒17號(編號1)缺少的第15點(diǎn)位帶、豐力新選8819線椒(編號3)缺少的第24點(diǎn)位帶；第2點(diǎn)位帶只在豐力新選8819線椒中出現(xiàn)，第5點(diǎn)位帶只在紫星2號(編號7)中出現(xiàn)，第21點(diǎn)位帶只在紅星2號(編號2)中出現(xiàn)；長椒類品種共檢測出20條蛋白質(zhì)亞基帶，有17條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為85%，都具有第9、12、16點(diǎn)位帶，而沒有第3、5、14、21、23點(diǎn)位帶；燈籠椒類品種共檢測出23條蛋白質(zhì)亞基帶，有15條多態(tài)性帶，多態(tài)性率為65%，都具有第9、10、12、15、16、17、24、25點(diǎn)位帶，而沒有第2、7點(diǎn)位帶；簇生椒類品種共檢測出15條蛋白質(zhì)亞基帶，沒有出現(xiàn)第2、3、5、7、12、18、20、21、22、25點(diǎn)位帶。

2.2 品種間的遺傳距離及遺傳相似系數(shù)

由表3可知，利用蛋白位點(diǎn)共計(jì)算得到品種間66個相似系數(shù)(S)和遺傳距離(GD)值，遺傳距離變異范圍在0.067～0.615之間，平均值為0.278 4；8819線椒(編號4)、豐力新選8819(編號3)的GD值相對最小，為0.067，華椒17(編號1)、紅星2號(編號2)的GD值相對最大，為0.615；白星2號(編號11)和紅星2號、紅妃(編號9)和紫星2號(編號7)、玉妃(編號12)和橙星2號(編號10)的GD值為0.273，處于居中水平，說明品種間有一定的遺傳差異。

2.3 聚類分析結(jié)果及親緣關(guān)系判斷

根據(jù)品種間遺傳距離的大小，采用系統(tǒng)聚類最短距離法逐級歸類可得到聚類圖。由圖2可知，歐氏距離平方約為5時，可將12個辣椒品種分為2大類，2大類之間的平均遺傳距離為0.313 1(平方歐式距離為9.818 7)；第Ⅰ類包括燈籠椒類品種紫星2號(編號7)、美國甜椒(編號6)、紅星2號(編號2)、橙星2號(編號10)、白星2號(編號11)和簇生椒類品種美國加州干椒王(編號5)，品種間的平均遺傳距離為0.236 7；第Ⅱ類包括長椒類品種8819線椒(編號3)、豐力新選8819(編號4)、楚風(fēng)辣椒(編號8)、紅妃(編號9)、玉妃(編號12)、華椒17(編號1)，品種間的平均遺傳距離為0.250 6；最先合并在一起的有美國甜椒和紫星2號(歐氏距離平方為0.058 8)、8819線椒和豐力新選8819(歐氏距離平方為 0.059 9)、紅妃和玉妃(歐氏距離平方為0.067 8)，說明這幾對品種間具有最近的遺傳距離，親緣關(guān)系也較近；簇生椒類變種與燈籠椒類變種在歐氏距離平方為0.115 9時被合并在一起，在歐氏距離平方為9.818 7時又與長椒類變種合并在一起。聚類分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，簇生椒類與燈籠椒類2個變種間具有很近的遺傳距離，平均遺傳距離為0.223 8，遺傳變異程度較小，具有較緊密的親緣關(guān)系；簇生椒類與長椒類2個變種間具有較遠(yuǎn)的遺傳距離，平均遺傳距離為0.310 3，遺傳變異程度較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；燈籠椒類與長椒類2個變種間的遺傳距離相對最遠(yuǎn)，平均遺傳距離為0.313 1，遺傳變異程度相對最大，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

3 結(jié)論

采用SDS-PAGE分析辣椒3個主栽變種12個品種的種子貯藏蛋白質(zhì)亞基組成，未檢測到醇溶蛋白，水溶蛋白、鹽溶蛋白、堿溶蛋白共檢測出25條蛋白質(zhì)亞基帶，多態(tài)性率為92%，亞基分布范圍是10 093～96 232 bp，蛋白質(zhì)亞基出現(xiàn)頻率變化幅度為0.08～1.00。長椒類品種共檢測出20條蛋白質(zhì)亞基帶，多態(tài)性率為85%；燈籠椒類品種共檢測出23條蛋白質(zhì)亞基帶，多態(tài)性率為65%；簇生椒類品種共檢測出15條蛋白質(zhì)亞基帶。采用系統(tǒng)聚類最短距離法對12個辣椒品種進(jìn)行聚類分析，12個品種被分為2大類，類內(nèi)的平均遺傳距離分別為0.236 7、0.250 6，類間的平均遺傳距離為0.313 1。簇生椒類與燈籠椒類2個變種間具有很近的遺傳距離，平均遺傳距離為0.223 8，變種間的遺傳變異程度相對較小，具有較緊密的親緣關(guān)系；簇生椒類與長椒類2個變種間具有較遠(yuǎn)的遺傳距離，平均遺傳距離為0.310 3，變種間的遺傳變異程度較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；燈籠椒類與長椒類2個變種間的遺傳距離相對最遠(yuǎn)，平均遺傳距離為0.313 1，變種間的遺傳變異程度相對最大，親緣關(guān)系也最遠(yuǎn)。

表2 12個辣椒品種種子貯藏蛋白電泳出現(xiàn)點(diǎn)位帶數(shù)和出現(xiàn)頻度

表3 12個辣椒品種間的遺傳距離及遺傳相似系數(shù)

注：對角線右上方的數(shù)字為遺傳距離，對角線左下方的數(shù)字為相似系數(shù)。