鄧 琳， 劉 靜， 張 咪， 黃 芳， 周水娟， 劉 倩， 梅 艷， 王 澤， 王 凱， 汪保華

[1.南通大學生命科學學院，江蘇南通 226019； 2.福建省海峽植物應用系統(tǒng)生物學重點實驗室(福建農(nóng)林大學)，福建福州 350002]

棉花是紡織工業(yè)的重要原料，也是重要的油料作物[1]。棉屬(GossypiumL.)包含4個栽培種，即草棉(G.herbaceum)、亞洲棉(G.arboreum)、陸地棉(G.hirsutum)、海島棉(G.barbadense)，其中陸地棉栽培對棉花產(chǎn)量貢獻最大。經(jīng)過長期的引種馴化，現(xiàn)代陸地棉栽培種已具備高產(chǎn)優(yōu)質等諸多優(yōu)良特性；然而，人類的選育也對遺傳多樣性造成一定的影響，并直接導致棉花對生物及非生物脅迫的抗性降低[2]。其中，棉花黃萎病病菌導致的土傳真菌維管束病害，即棉花黃萎病，在生產(chǎn)中極具毀滅性且難以防治[3]。在棉花育種實踐中，利用野生資源拓寬棉花遺傳多樣性，發(fā)掘野生棉一些新的基因位點對陸地棉改良有明顯的作用[4]。原產(chǎn)于巴西的黃褐棉(G.mustelinum)[5]在野生異源四倍體棉種里與陸地棉遺傳距離較遠[6]，且具有抗黃萎病的優(yōu)良特性，其優(yōu)異的等位基因對改良陸地棉抗黃萎病具備潛在的重要價值。

Tanksley等提出的回交高世代數(shù)量性狀基因座(advanced backcross quantitative trait locus，簡稱AB-QTL)分析法，解決了從野生種導入優(yōu)良基因到栽培品種的問題[7]。Paterson等提出了利用導入系(introgression line，簡稱IL)作圖群體進行QTL精細定位，并取得了良好效果[8]。張星星等在BC3F3種子中鑒定出來自加拿大優(yōu)質強筋小麥品種Glenlea的Glu-A1a、Glu-B1al、Glu-D1d位點不同組合的7種導入系材料，研究表明，DLGlu1可用于Glu-1 位點近等導入系的快速創(chuàng)制，對Glu-1位點功能研究和改良具有重要價值[9]。張蕾等研究的由小麥和中間偃麥草Z1141雜交、回交而來的高代導入系CH7124，在苗期高度耐受鹽脅迫環(huán)境，后續(xù)用100個簡單重復序列(simple sequence repeats，簡稱SSR)標記對親本CH7124和綿陽11以及F2群體的耐鹽/敏感池進行篩選，結果獲得2個多態(tài)性標記Xwmc175、Xgwm213[10]。潘曉雪等以死苗率為鑒定指標，對糯稻89-1導入系群體(BC1F9)進行苗期耐寒性鑒定試驗，篩選出強抗寒性株系并對篩選出的株系進行了生理生化分析[11]。

為揭示棉花抗病的遺傳基礎，許多研究者已經(jīng)進行了獨立的研究，并在一些定位群體中檢測出許多與棉花抗病性相關聯(lián)的QTL。Guo等利用2個黃萎病抗性品系5026、60182鑒定了25個與抗病相關的QTL，4個優(yōu)良QTL分別位于5號、6號、8號、13號染色體上[12]。Zhao等基于疾病苗圃和溫室環(huán)境，通過關聯(lián)作圖鑒定了與黃萎病抗性相關的42個QTL，廣泛分布在15條染色體中，16號染色體上的抗性QTL簇也在其研究中得到證實，這與該染色體的緊密連鎖具有一致性[13]。Ning等在抗性Acala-Prema和易感栽培種86-1之間的雜交群體中檢測到7個位于1號、3號、5號、7號染色體上的抗性QTL[14]。Fang等構建了易感Sure-Grow 747(陸地棉)與抗性Pima S-7(海島棉)雜交的回交高世代群體，檢測到在4號、19號等染色體上的共42個QTL，增效親本大多來自抗性Pima S-7[15]。Jiang等利用抗性棉花材料60182與易感栽培品種Junmian 1雜交，在7號和9號染色體上同時篩選出具有高貢獻率的QTL簇，這對改善棉花育種的計劃有所促進[16]。Bolek等利用高度耐受的棉花品系Pima S-7(海島棉)和易感的Acala 44(陸地棉)雜交，通過具有明顯連鎖關聯(lián)的15個標記，共檢測出9個分布于10號、11號、12號、25號染色體的QTL[17]。

針對棉花抗黃萎病相關表達序列標簽(expressed sequence tag，簡稱EST)資源，筆者所在團隊已開發(fā)106對有效、非冗余的抗黃萎病SSR標記，并對所開發(fā)的引物進行評價，同時進行棉屬種間轉移性研究，成效顯著[18]。本研究在利用Wang等將陸地棉與黃褐棉雜交而構建的回交高世代群體[19]的基礎上，分子標記輔助選擇抗病表現(xiàn)優(yōu)異的近等基因系，并結合病圃的表型差異，在構建的棉花導入系群體中對抗病QTL進行鑒定和分析，以期為抗病QTL精細定位及抗病分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 用于QTL定位的黃褐棉導入系群體的培育

前期研究中以陸地棉PD94042(P1)為受體親本、以黃褐棉(G.mustelinum)(P2)為供體親本進行雜交，并以陸地棉PD94042(P1)為輪回親本構建了回交高世代群體[19]，從中選育出1組覆蓋棉花全基因組的導入系(共計65份材料)，其過程主要包括親本雜交獲得F1代，然后與陸地棉回交3次獲得回交3代，再進行自交，獲得試驗需要的導入系群體(圖1)。

1.2 導入系群體黃萎病抗性鑒定

導入系群體及2個親本分別在2011年種于江蘇省南通市(環(huán)境1)、鹽城市(環(huán)境2)兩地，各家系按行種植，隨機區(qū)組設計，2次重復，每個重復每行材料種植5株。2013年12月份鑒定發(fā)生黃萎病劈稈的病情指數(shù)，病級劃分參照吳征彬的方法[20](表1)，病情指數(shù)計算公式如下：

式中：R是某一家系的黃萎病病情指數(shù)；X是病級(0～4)；Y是某一病級的單株數(shù)；α是所調(diào)查家系的棉花單株總數(shù)。

表1 棉花黃萎病病級劃分標準

1.3 DNA提取、PCR擴增和電泳檢測

對各材料的基因組DNA采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltriethyl ammnonium bromide，簡稱CTAB)法提取，用紫外分光光度計檢測其濃度[21]。

PCR反應體系總體積為10 μL，具體包括1.0 μL 10×Reaction buffer(不含Mg2+)，1.0 μL Mg2+(25 mol/L)，1.0 μL dNTP(10 mmol/L)，各0.5 μL上、下游引物(10 μmol/L)，0.2 μLTaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)，1.0 μL模板DNA(50 ng/μL)，4.8 μL ddH2O，上覆10.0 μL液體石蠟油。

PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min；最后在4 ℃冷卻保存。

聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱PAGE)方法：用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測，在擴增產(chǎn)物中加入3 μL溴酚藍上樣緩沖液混勻，從中取2.5 μL加入點樣孔，并用50 bp DNA Ladder進行標記。在電泳緩沖液為1×Tris-硼酸，150 V恒壓環(huán)境下電泳 1.5 h。銀染分析：在He等的方法[22-23]基礎上稍加改良，經(jīng)固定、銀染、顯色、水洗等步驟后，拍照保存。

1.4 導入系群體的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

1.4.1 基因型數(shù)據(jù)統(tǒng)計 通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，參考DNA Ladder標準記載，對比條帶顯示結果，記錄親本及子代SSR標記的類型，共顯性標記記錄中，與親本P1相同的純合帶型記為“1”，與親本P2相同的純合帶型記為“2”，兩親本的雜合帶型記為“3”；當親本P1為顯性、親本P2為隱性時，P1、F1的帶型記為“5”，P2的帶型記為“2”；當親本P2為顯性、親本P1為隱性時，P2、F1的帶型記為“4”，P1的帶型記為“1”；模糊或缺失數(shù)據(jù)記為“0”。將每個標記的數(shù)據(jù)輸入Excel表格。

1.4.2 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計 將病圃的表型數(shù)據(jù)進行相應的統(tǒng)計分析，計算其相應的病情指數(shù)。

1.5 黃萎病抗性QTL定位

綜合導入系群體的基因型數(shù)據(jù)，首先對于標記之間的連鎖關系用MapMaker 3.0軟件進行分析，構建分子標記的遺傳連鎖圖譜。利用Win QTL Cart 2.5軟件將病圃的表型數(shù)據(jù)結合基因型數(shù)據(jù)開展黃萎病抗性QTL定位，檢測QTL最低連鎖系數(shù)(likelihood of odds，簡稱LOD)值為2.5，最后對于目標QTL在染色體或連鎖圖譜上的位置用MapChart繪圖軟件進行繪制。

2 結果與分析

2.1 抗病表型分析

病情指數(shù)越低，抗性越高。由圖2可知，陸地棉絕大部分為易感病材料，黃褐棉為抗病材料。根據(jù)統(tǒng)計結果可以證明該導入系群體中存在一定量抗病相關的黃褐棉漸滲片段，從而使得該導入系群體抗病性得到提高。

2.2 抗病QTL分析

由表2可知，在2種環(huán)境下共檢測到10個抗病性QTL，其中，在環(huán)境1下檢測到2個QTL，qVW-5-1定位在5號染色體60.09 cM處，側鄰標記為CICR016-CICR186，LOD值為3.4，解釋17.6%的表型變異率，病指增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；qVW-9-1定位在9號染色體14.99 cM處，側鄰標記為CICR658-BNL3779，LOD值為2.7，解釋 14.6% 的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；在環(huán)境2下檢測到8個QTL，qVW-4-1定位在4號染色體0.01 cM處，側鄰標記為DPL0085-BNL530，LOD值為 2.7，解釋14.0%的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；qVW-10-1定位在10號染色體0.01 cM處，側鄰標記為BNL1438-CICR002a，LOD值為2.8，解釋14.0%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；qVW-16-1定位在16號染色體79.67 cM處，側鄰標記為CICR166b-BNL1604，LOD值為2.6，解釋19.1%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；qVW-18-1定位在18號染色體 49.51 cM 處，側鄰標記為BNL1721-MUSS603，LOD值為 2.7，解釋17.9%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；定位于19號染色體的抗病QTL有3個，其中qVW-19-1定位在19號染色體312.67 cM處，側鄰標記為BNL3029-DPL0444，LOD值為2.9，解釋18.6%的表型變異率，增效基因貢獻親本為黃褐棉；另外qVW-19-2定位在19號染色體33.52 cM處，側鄰標記為CICR524-CICR056，LOD值為2.6，解釋21.9%的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042；qVW-19-3定位在19號染色體70.39 cM處，側鄰標記為BNL3811-MUSS118，LOD值為3.0，解釋18.7%的表型變異率，增效基因貢獻親本為陸地棉PD94042。特別地，位于22號染色體上的QTLqVW-22-1可解釋39.3%的表型變異率，且LOD值高達4.8，其病情指數(shù)增效基因來自陸地棉，即黃褐棉等位基因具有抗病作用，有必要開展深入研究。

表2 QTL定位結果

用繪圖軟件MapChart繪制目標QTL在染色體或連鎖圖譜上的位置，如圖3所示：圖中為qVW-22-1主效QTL的遺傳圖譜分析，圖上劃線標記的是QTL的多態(tài)性位點，顯示的是可能存在于該區(qū)間的抗病QTL，線性標注即是該區(qū)間的范圍，而中間的矩形實心區(qū)域是可能性較大的QTL位置，這表明更為精細的位點可能在此區(qū)域；右邊的矩形方框是根據(jù)LOD值所畫的散點圖。

3 討論

在眾多作物(水稻[24]、大豆[25]、棉花[26]等)中均有報道通過高世代回交和分子標記輔助選擇相結合來構建染色體片段代換系，但具有黃褐棉染色體片段代換系的報道較少。本研究所用親本材料中的PD94042是感病陸地棉品系，另一個親本是高抗黃萎病的黃褐棉品系，兩親本在抗黃萎病性狀方面差異明顯，因此利于進行抗病QTL研究。

前人研究中，已報道許多棉花黃萎病抗性QTL[27-28]。劉劍光等構建的一個以棉花抗黃萎病品系蘇抗045和感黃萎病品系蘇研116為親本的含有237個F2單株的群體中，在NAU2970-MUSS138區(qū)間內(nèi)檢測到1個定位于5號染色體上的抗黃萎病QTL，可解釋9.69%的表型變異率[29]。Shi等構建了來自高抗性品系Hai1(海島棉)和易感品種CCRI36(陸地棉)作為輪回親本的BC1F1、BC1S1、BC2F1群體，在全棉基因組中使用來自BC1F1群體的高密度簡單重復序列遺傳連鎖圖譜檢測與抗病抗性相關的QTL共48個，其中定位于19號染色體上的抗病QTL側鄰標記NAU5489與筆者所在實驗室鑒定的qVW-19-3側鄰標記相距甚小，可能有一定的相關性，位于22號染色體上的QTL側鄰標記CICR0438也出現(xiàn)在本研究的圖譜上；同時也檢測出來自5號、9號、10號染色體上的許多QTL，但由于缺乏共同標記，難以比較[30]。Yang等利用耐受品種Hai7124(海島棉)與易感品種Junmian 1(陸地棉)進行雜交，檢測到定位于4號染色體上的抗病QTL側鄰標記NAU3437也在筆者所在實驗室的檢測范圍內(nèi)，與筆者所在實驗室鑒定的qVW-4-1可能具有一定的關聯(lián)[31]。

本研究檢測到的抗病QTL大多離散地分布在多條染色體上， 而在19號染色體連鎖群上有3個QTL，這些QTL主要集中在標記DPL0444、CICR056、MUSS118附近，這種QTL成簇分布現(xiàn)象在其他研究中也有報道，在棉花基因組中可能存在著對棉花生長發(fā)育具有更大作用的高度重復的基因富集區(qū)，QTL能發(fā)揮多重功能以彌補數(shù)量上的不足[32]。后續(xù)的研究將對一些重點QTL開展精細定位，同時進行標記輔助選擇，以期為棉花抗黃萎病育種實踐服務。