喬峰，王敬民，李敬華，程棟，劉艷紅，石瑜

（淄博市農(nóng)業(yè)科學研究院，山東淄博255000）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）能夠侵染熱帶和溫帶植物的根系，是世界上對植物破壞性最大的病原體之一[1]。由于溫室多年連作或購買帶線蟲苗木等原因，使溫室土壤中根結(jié)線蟲增多，嚴重危害了蔬菜、果樹等經(jīng)濟作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上比較認可的防治方法是栽培持續(xù)高抗的蔬菜、果樹品種。因此，在果樹育種過程中需要一種簡便、快速、準確的鑒定抗性品種方法，本文介紹了不同的接種源和不同接種源的獲取方法，以及它們對根結(jié)線蟲抗性篩選的影響和常用的抗性鑒定方式，如一般接種、高持續(xù)性接種等。分析了適用于果樹的發(fā)根農(nóng)桿菌介導的組織培養(yǎng)接種，并指出抗線蟲植株鑒定篩選的趨勢是向快速、簡便、準確的分子標記方向發(fā)展。

1 接種源及其獲取方法對根結(jié)線蟲抗性篩選的影響

一般根結(jié)線蟲的接種源分為卵塊、卵、二齡幼蟲，由于卵塊的收集時間較長，且每個卵塊中卵的數(shù)量不同，較難形成統(tǒng)一的接種標準；接種時，卵塊為塊狀，不易均勻分散在果樹根系周圍；另外，其他病原體和根腐病菌易通過卵塊侵染植物，引起病害。接種二齡幼蟲時，要確保獲得接種源后及時接種，以防止幼蟲死亡或侵染力下降；同時，需保證二齡幼蟲適宜的生存環(huán)境，防止二齡幼蟲死亡或侵染力下降。卵的獲取較方便快捷，可通過NaClO溶液沖洗獲得[2]；獲取過程中，卵的表面得到消毒，不會攜帶病原體；接種時，通過制定一定濃度的懸浮液，保證統(tǒng)一接種量，且可均勻侵染果樹根系。

不同的接種源獲取方法對抵抗根結(jié)線蟲的侵染有一定的影響。根據(jù)Hussey 1973的報道，用離心機或機械粉碎獲得卵的方法對其孵化和侵染力都有一定的破壞作用，如卵的孵化率降低和卵的數(shù)量減少[2]；在潮濕環(huán)境中，孵化的根結(jié)線蟲侵染率更低。用1.05%NaClO溶液沖洗[2]獲得卵的方法對其孵化和侵染力影響較小，并證明用1.05%NaClO溶液沖洗收集到的卵作為接種源最合適。

2 鑒定方式

2.1 接種方式

2.1.1 一般的接種方法

在鑒定篩選抗性果樹植株時，常用含有一定數(shù)量的二齡幼蟲懸浮液接種。通過控制每株接種二齡幼蟲懸浮液的濃度和體積控制接種量。具體操作方法如下：用移液槍在距離植株莖基部1cm左右，注射到2cm深的小孔中[3]，7d后觀察植株根系的變化，包括根結(jié)數(shù)量、根結(jié)指數(shù)，或30d左右測定每株根系中卵、二齡幼蟲或雌蟲數(shù)量（線蟲的數(shù)量可通過酸性品紅染色的方法計數(shù)），從而確定植株的抗性級別。木本植物中，常用根結(jié)指數(shù)分級標準[4]（表1），在分級的基礎(chǔ)上，計算病情指數(shù)并確定抗性級別。該方法簡便、快速，接種量標準統(tǒng)一，但在篩選抗性果樹植株中不容易區(qū)分出高抗植株。

表1 抗性分級標準Table 1 Grading standard of resistance

2.1.2 高持續(xù)性接種

高持續(xù)性接種能夠明顯區(qū)分出高抗植株，通過連續(xù)大量的對篩選植株接種，獲得的抗性植株較準確。具體操作如下：在接種前，培育大量感病的番茄苗，當番茄長到5葉齡時，接種500條二齡幼蟲；2個月后，部分番茄苗去掉地上部分，把其根系和土壤整體移到被鑒定植株的營養(yǎng)缽內(nèi)，一段時間后，測定根結(jié)數(shù)等指標；剩余番茄苗作對照，去掉地上部分，每隔一段時間測定土壤和番茄根系內(nèi)線蟲和卵的數(shù)量，從而確定各個時期的接種量[5]。高持續(xù)性接種保證了接種根結(jié)線蟲的持續(xù)性，能夠較好地區(qū)分高抗植株，但接種數(shù)量不易被確定或不準確。

2.2 離體抗性鑒定及其改進

2.2.1 離體抗性鑒定

果樹根系生長時間長，如果用常規(guī)育苗方式，如綠枝扦插、硬枝扦插等，一年中只能繁育2～3批鑒定的果樹苗木，嚴重影響植物抗性鑒定的進度。組織培養(yǎng)育苗能夠?qū)崿F(xiàn)周年育苗，確保為抗根結(jié)線蟲的鑒定提供充足植株。組織培養(yǎng)育苗后，通過煉苗移栽然后鑒定其抗性，或直接在培養(yǎng)基中接種根結(jié)線蟲鑒定其抗性。

組織培養(yǎng)育苗鑒定根結(jié)線蟲抗性時，需確定外源生長素是否對組織培養(yǎng)獲得的植株產(chǎn)生抗性修飾，導致其抗性消失或增強。有文章已報道桃樹在組織培養(yǎng)過程中受外源萘甲酸的影響，其抗性降低[6]，但Esmenjaud等[5]證明通過組織培養(yǎng)獲得的紫葉李對根結(jié)線蟲的抗性不受外源激素影響。因此，在利用組織培養(yǎng)擴繁抗性鑒定植株時，需要鑒定生長素及其不同濃度對擴繁植株抗性的影響，才能鑒定其抗性。結(jié)合組織培養(yǎng)的方式鑒定植株對根結(jié)線蟲的抗性，能夠縮短鑒定時間，且在一年內(nèi)可多次育苗，實現(xiàn)多次鑒定。

2.2.2 培養(yǎng)基內(nèi)抗性鑒定

在土壤中很難觀察果樹根系對根結(jié)線蟲的抗性程度，且不能直接觀察根結(jié)線蟲的侵染過程。培養(yǎng)基內(nèi)鑒定植株對根結(jié)線蟲的抗性能夠觀察到根結(jié)線蟲的侵染過程及發(fā)病情況，但需要排除外源激素、培養(yǎng)基等因素的影響，并且植株能夠快速生長出大量根系。1991年，Sijmons等人[7]在培養(yǎng)基中鑒定植株對根結(jié)線蟲的抗性以及觀察根結(jié)線蟲的侵染過程，篩選出易被根結(jié)線蟲侵染的擬南芥和適宜根結(jié)線蟲侵染的培養(yǎng)基，確定了生根培養(yǎng)基—Knop（1860）對根結(jié)線蟲的侵染不會產(chǎn)生影響，并證明蔗糖的濃度及質(zhì)量和培養(yǎng)基的硬度都會影響到根結(jié)線蟲的侵染效率。利用擬南芥根系細并且透明的特點，在培養(yǎng)基中能夠觀察到根結(jié)線蟲的侵染和生長發(fā)育過程。該方法證實在培養(yǎng)基內(nèi)鑒定植株對根結(jié)線蟲抗性和觀察根結(jié)線蟲在植株根系中生長發(fā)育的可行性，表明在室內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)一年多次對植株根結(jié)線蟲抗性的鑒定。

果樹植株生根較慢，可通過發(fā)根農(nóng)桿菌促進植株在培養(yǎng)基內(nèi)快速生根[8]，實現(xiàn)培養(yǎng)基內(nèi)快速鑒定。2006年，Alpizar等[9]向咖啡樹中轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，促使植株快速生長出大量毛狀根，鑒定其對根結(jié)線蟲的抗性，證明發(fā)根農(nóng)桿菌不會改變植株對根結(jié)線蟲的抗性。2011年，Bosselut等[10]鑒定紫葉李對根結(jié)線蟲抗性時，也通過發(fā)根農(nóng)桿菌侵染紫葉李促使其發(fā)根并在培養(yǎng)基中接種根結(jié)線蟲，鑒定其抗性。以上試驗說明發(fā)根農(nóng)桿菌能夠促進組培苗生根且不影響植株對根結(jié)線蟲的抗性鑒定。

3 小結(jié)

抗根結(jié)線蟲植株的篩選是一個復雜的過程，篩選植株的方法已經(jīng)從田間鑒定發(fā)展到試驗室內(nèi)，但也需要準確的抗性評定標準。抗性的評定指標很多，如根結(jié)指數(shù)、每克根中雌線蟲數(shù)、二齡幼蟲數(shù)、卵數(shù)和總的線蟲數(shù)量等，這些指標均是形態(tài)學上的分析評定，對極抗病植株和極感病植株的判斷較準確，但是對中間類型的判斷比較模糊。考慮到從育苗到接種，再到抗性評價整個過程的繁瑣性，需要從分子層面準確的鑒定植株抗性。相信隨著分子技術(shù)地不斷發(fā)展與成熟，以及抗性基因的發(fā)現(xiàn)，從分子方面快速準確的鑒定抗性是一種發(fā)展趨勢。