李家宇 左之文 王曦璠 陳林 王璽 賀煒 周卿意駿 張水寒

〔摘要〕 目的 運用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對黨參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen及川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的游離糖成分進行分析鑒定。方法 采用震蕩提取法從黨參中提取多種游離糖化合物，游離糖成分經(jīng)乙?；罄脷庀嗌V-質(zhì)譜法分析其組成、結(jié)構(gòu)。結(jié)果 通過氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)合標準品數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻，鑒別出3種黨參中7種游離糖成分，分別為山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖，游離糖含量存在差異。結(jié)論 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可以對黨參游離糖成分進行定性及定量分析，為黨參品質(zhì)分析提供科學依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 黨參;乙?；?游離糖;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

〔中圖分類號〕R284.1? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.12.010

黨參作為一味傳統(tǒng)的名貴中藥材，來源為桔?？浦参稂h參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen或川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根[1]。其味甘性平，具有補中益氣、健脾益肺之功效[2]。主治脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內(nèi)熱消渴等癥[3]。黨參之名始見于《本草從新》，書中所述的“真黨參”系指產(chǎn)于山西上黨（今山西長治）的五加科人參[4]。隨著五加科人參資源的減少，形似人參的替代品被采用，至清代已將根有獅子盤頭的一類替代藥材獨立出來作為新的藥材品種，并定名黨參。

黨參的質(zhì)量評價一直備受關(guān)注，“味甜者佳”的觀點作為民間判斷黨參質(zhì)量優(yōu)劣的方式，但存在缺陷，如何更加客觀、科學地評價黨參甜度與質(zhì)量的關(guān)系值得研究。通常，“甜味”的強弱用甜度來表示[5]，而甜度與游離糖的含量相關(guān)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）方法具有高分離度、高速度、高靈敏度等特點，已在眾多領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用[6-8]。因而，本文采用GC-MS分析方法對不同品種、不同產(chǎn)地黨參中的游離糖成分進行了快速測定和比較，以期為黨參品種甄別和品質(zhì)分析提供科學參考。

1 材料與方法

1.1? 材料與試劑

甲醇（德國Merck公司）、乙酸（美國Tedia公司）為色譜純;其他試劑均為分析純;實驗用水采用重蒸純凈水（華潤怡寶飲料長沙有限公司）。單糖標準品：D-木糖、鼠李糖、巖藻糖、阿拉伯糖、核糖醇、L-阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、D-甘露糖、肌醇、甘露醇、D-山梨醇、蔗糖、半葡胺標準品（長沙錦農(nóng)生物科技有限公司）。

本實驗所采用的24批黨參藥材（見表1）分別采集自山西省晉城市、甘肅省文縣、湖北省恩施縣及四川省甘孜州等地，經(jīng)湖南省中醫(yī)藥研究院湖南中藥研究所劉浩助理研究員鑒定，分別為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula （Franch.） Nannf.的干燥根、素花黨參 Codonopsis? pilosula? Nannf. var. modesta （Nannf.） L. T. Shen的干燥根、川黨參Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，均為2015版《中華人民共和國藥典》所收載的品種。

1.2? 儀器

GC-2014氣相色譜儀（日本島津公司）;NDK200-1氮吹儀（杭州米歐儀器廠）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;SHZ-DIII循環(huán)水式真空泵（上海貝侖儀器設(shè)備有限公司）;KM-500DB臺式超聲波清洗器（昆山市美美超聲儀器有限公司）;HC-700高速多功能粉碎機（永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司）;AE240電子天平（瑞士梅特勒-托利多國際有限公司）。

1.3? 氣相色譜檢測條件

VF-23 ms（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 毛細管柱;載氣為高純氦;柱流量1.0 mL/min;分流比45∶1;進樣口溫度220 ℃;柱壓73.0 kPa;程序升溫：起始溫度100 ℃，10 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，1 ℃/min升至190 ℃，保持2 min，30 ℃/min升至220 ℃，保持2 min，0.5 ℃/min升至222 ℃，保持3 min，0.5 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。

1.4? 質(zhì)譜檢測條件

電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度220 ℃，接口溫度250 ℃，質(zhì)量掃描范圍45～550 m/z。

1.5? 標準品及供試品溶液的制備

1.5.1? 標準品溶液的制備? 精密稱取5.0 mg核糖醇標準品，溶于50.0 mL二甲亞砜（DMSO）中，定容[9]。配制成0.1 mg/mL的核糖醇-二甲亞砜溶液備用。精密稱取0.1 mg標準品，溶于0.2 mL核糖醇-二甲亞砜溶液（0.1 mg/mL）中。以0.03 mL 1-甲基咪唑為催化劑，0.2 mL乙酸酐為乙?；噭10]，30 ℃水浴，振蕩、攪拌10 min，加1.0 mL蒸餾水，除去過量乙酸酐，終止反應(yīng)。以0.2 mL二氯甲烷萃取2次，合并后用無水硫酸鈉除去殘留水分，過0.22 μm濾膜，備用。

1.5.2? 黨參供試液的制備? 將樣品置于烘箱中干燥至恒重。精密稱取樣品細粉50.0 mg，置于10.0 mL離心管中。加入1 mL含0.1 mg/mL核糖醇提取液（三氯甲烷∶甲醇∶水=12∶5∶1），4 ℃震蕩過夜。3 000 r/min離心10 min，取上層清液，揮干。復(fù)溶于0.1 mL二甲亞砜中，以0.03 mL 1-甲基咪唑為催化劑，0.2 mL乙酸酐為乙?；噭?，30 ℃水浴，振蕩、攪拌10 min，加1.0 mL蒸餾水終止反應(yīng)。以0.5 mL二氯甲烷萃取2次，將下層有機層提取、合并后用無水硫酸鈉除去殘留水分，過0.22 μm濾膜，備用。

1.6? 方法學考察

1.6.1? 精密度試驗? 取CT-01號樣品溶液，按“1.5.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”項色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄峰面積，分別計算相對標準偏差（relative standard deviation， RSD）。

1.6.2? 重復(fù)性試驗? 取同一批黨參樣品5份，按“1.5.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.3”項色譜條件進行分析測定，分別計算RSD。

1.6.3? 穩(wěn)定性試驗? 取同一份置于4 ℃冰箱內(nèi)的供試品溶液，按“1.3”項色譜條件在0、2、4、8、12、24 h分別進行測定，分別記錄峰面積，分別計算RSD。

1.7? GC-MS測定黨參中的游離糖的含量

按“1.5.1”項下方法制備標準品供試溶液，以核糖醇標準品為內(nèi)標試樣，分別進樣0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 ？滋L分別計算核糖醇的標準曲線以及各標準品與核糖醇的相對校正因子。

按“1.5.2”項下方法制備樣品供試溶液，取2.0 ？滋L供試溶液注入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析系統(tǒng)。根據(jù)單糖及糖醇標準品的氣相色譜質(zhì)譜的色譜圖進行分辨，對樣品中的糖類化合物進行定量分析。

糖類化合物含量計算公式：

mi=f×（Ai×ms）/As

mi、ms分別表示待測糖以及內(nèi)標試樣的質(zhì)量，Ai、AS分別表示待測糖以及內(nèi)標試樣的峰面積，f表示待測糖和內(nèi)標的相對校正因子。

2 結(jié)果

2.1? 黨參游離糖組成及含量

17個標準物質(zhì)的混合樣品，經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜分析所得色譜圖見圖1（A），不同黨參的樣品中游離糖衍生物經(jīng)過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜分析所得色譜圖見圖1。

進一步利用NIST05庫進行搜索與匹配，對17種標準物質(zhì)進行鑒定，所得結(jié)果如表2所示。其中，內(nèi)標核糖醇的標準方程為

ms=2.0×10-7As+7.7×10-3，r=0.999 0

2.2? 方法學考察

精密度：山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖的RSD分別為0.20%、0.13%、0.16%、0.21%、0.19%、0.22%、0.22%，表明儀器精密度較好。

重復(fù)性：山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖的RSD分別為0.23%、0.17%、0.18%、0.25%、0.23%、0.22%、0.24%，表明方法的重復(fù)性較好。

穩(wěn)定性：山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖的RSD分別為0.19%、0.15%、0.18%、0.22%、0.21%、0.22%、0.23%，表明供試品溶液在4 ℃條件下，24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3? 不同黨參樣品的游離糖組成及含量分析

對黨參樣品采用相同的預(yù)處理并對黨參中的糖及糖醇類成分采用相同分析條件進行定量分析，不同品種黨參游離糖組成及含量見表3。黨參主要包括山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、果糖、肌醇、蔗糖，且這7種糖及糖醇成分的含量在不同黨參中存在差異。

3 討論

研究系首次通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析2015版《中華人民共和國藥典》中收錄的3種黨參游離糖的含量，發(fā)現(xiàn)不同品種的黨參游離糖有相同點及差異性。相同點為不同黨參所含游離糖種類基本相同，均包括山梨糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、肌醇、蔗糖在內(nèi)的6種游離糖。差異性則表現(xiàn)在不同品種黨參游離糖的百分含量有顯著差異性;桔?？浦参稂h參的干燥根中可檢出D-甘露糖，而素花黨參及川黨參的干燥根中未檢出D-甘露糖。D-甘露糖可作為辨別桔?？浦参稂h參的標志性單糖成分。3種黨參中最主要的游離糖成分均為果糖和葡萄糖。在對黨參甜度的貢獻上，果糖對甜度的影響最大，其次為蔗糖，這兩種糖類成分在黨參中的含量較高，占游離糖成分90%以上，對黨參的甜味的影響相較于其他糖明顯。山梨糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、肌醇等糖類成分，由于在黨參中的含量較低，對黨參的甜度影響作用較小。

本研究通過GC-MS分析結(jié)合標準品數(shù)據(jù)以及相關(guān)文獻，在保留時間、分子式等方面對黨參游離糖成分進行定性及定量分析。建立了一種準確、快速的中藥黨參游離糖分析方法，此方法可為黨參品質(zhì)分析提供游離糖成分方面的參考，并為黨參干燥加工提供指導(dǎo)。

參考文獻：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].一部.北京：化學工業(yè)出版社，2015：264.

[2] 楊鵬飛，楚世峰，陳乃宏.黨參的藥理學研究進展及其抗腦缺血再灌注損傷的機制[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2015，35（12）：5-10.

[3] 焦紅軍.黨參的藥理作用及其臨床應(yīng)用[J].中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2012，25（19）：92-92.

[4] 鄒蔭甲.黨參的本草學考證[J].中草藥，2000，31（6）：466-467.

[5] BELITZ H D， GROSCH W， SCHIEBERLE P.食品化學：第3版[M].中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2008.

[6] 陳曉水，侯宏衛(wèi)，邊照陽，等.氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）的應(yīng)用研究進展[J].質(zhì)譜學報，2013，34（5）：308-320.

[7] DIMITRA J D， BASIL N Z， MOSCHOS G P， et al. GC-MS analysis of essential oils from some greek aromatic plants and their fungitoxicity on penicillium digitatum[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry， 2000， 48（6）：2576-2581.

[8] LUEDEMANN A， STRASSBURG K， ERBAN A， et al. TagFinder for the quantitative analysis of gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS）-based metabolite profiling experiments[J]. Bioinformatics， 2008， 24（5）：732-737.

[9] 高凡茸.黃芪藥材甜味與品質(zhì)關(guān)聯(lián)性研究及黃芪糖譜分析方法的建立[D].太原：山西大學，2015.

[10] 廖洪梅，戴? 玲，魏曉飛，等.單糖乙?；瘲l件的優(yōu)化[J].理化檢驗·化學分冊，2008，44（5）：441-443.