丁文姣 于安芬 李瑞琴 徐瑞 白濱

摘要：為明確黃芪根腐病致病機(jī)制，探索感病植株在物質(zhì)代謝上對毒素的響應(yīng)，將分離所得茄病鐮刀菌毒素粗提物稀釋成不同濃度脅迫處理黃芪幼根，對處理后的幼根蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測定。結(jié)果表明，隨著毒素脅迫時間的延長，黃芪幼根蛋白質(zhì)含量均快速下降，這可能是隨著毒素作用時間的延長，破壞了植株體內(nèi)的正常代謝，進(jìn)而抑制了蛋白質(zhì)的合成。毒素脅迫后黃芪幼根可溶性糖含量降低得快，說明植株體內(nèi)呼吸作用加強(qiáng);脯氨酸含量則隨著脅迫時間和毒素濃度的增加而增加，說明黃芪幼苗對毒素危害表現(xiàn)為敏感響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：根腐病菌;粗毒素;黃芪幼苗;物質(zhì)代謝

中圖分類號：S567.23? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：1001-1463（2018）12-0031-04

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.12.010

黃芪根腐?。ˋstragalus Root Rot）是黃芪的重要病害之一，它是一種分布較廣、危害較重、致病的病原種類多和防治困難的常發(fā)土傳病害，其主要病原菌為鐮刀菌，以土壤帶菌和植株的病殘?bào)w進(jìn)行傳播[1? ]。黃芪普遍種植于甘肅各地，尤以甘肅中部的定西等地種植最多，種植面積也不斷擴(kuò)大，輪作周期縮短，連作面積增加，導(dǎo)致黃芪根腐病越來越嚴(yán)重。被根腐病危害的黃芪植株地上部生長衰弱，地下部被害后主、側(cè)根出現(xiàn)褐色壞死病斑，嚴(yán)重時根皮腐爛呈纖維狀，直接影響黃芪的產(chǎn)量和品質(zhì)。我們在對甘肅中部地區(qū)黃芪根腐病原的研究中發(fā)現(xiàn)，茄病鐮刀菌（F. solani）是該區(qū)域黃芪根腐病的優(yōu)勢病原菌[2 ]。鐮刀菌可產(chǎn)生對植物組織和細(xì)胞有明顯毒害作用的毒素[3 - 5 ]，脯氨酸和可溶性糖在高等植物的抗逆生理中發(fā)揮著重要的作用[6 ]，是在各種生物體內(nèi)均有分布的滲透保護(hù)物質(zhì)，在毒素脅迫下，高等植物通過增加細(xì)胞內(nèi)的脯氨酸和可溶性糖含量來維持細(xì)胞的滲透壓?？扇苄缘鞍踪|(zhì)是重要的營養(yǎng)物質(zhì)，它的增加和積累能提高細(xì)胞的抗性，增強(qiáng)細(xì)胞對逆境脅迫的抵抗能力[7 - 10 ]。為探明黃芪根腐病優(yōu)勢病菌毒素對黃芪的致病機(jī)制毒素與黃芪根系間的互作關(guān)系，我們通過用不同濃度黃芪根腐病粗毒素對黃芪幼苗根系苗不同時間處理，然后對幼根可溶性蛋白質(zhì)、可溶性糖、脯氨酸等3種物質(zhì)代謝指標(biāo)的含量進(jìn)行了研究，以期為進(jìn)一步從生理生化方面探究其抗病性機(jī)制和植株對毒素的響應(yīng)機(jī)制。

1? ?材料與方法

1.1? ?供試菌種

供試菌種為前期經(jīng)分離純化鑒定所得的黃芪根腐病優(yōu)勢致病菌茄病鐮刀菌（F. solani）[11 ]。

1.2? ?供試植株

選取大小均勻飽滿的當(dāng)年黃芪種子，用90%濃硫酸浸泡 4 min后用流水沖洗 15～30 min，以破除種子硬實(shí)現(xiàn)象。將處理后的種子用濕紗布覆蓋并置于培養(yǎng)皿中，待種子露白后分別種于裝滿無菌蛭石的營養(yǎng)缽中，每盆種已露白的種子6～7粒培養(yǎng)。待黃芪出苗、子葉完全展開時，用 1/2 Hoag-land 營養(yǎng)液澆灌，然后每7 d加1次1/2 Hoag-land 營養(yǎng)液，其余時間噴灑蒸餾水保濕。待黃芪幼苗第2片復(fù)葉完全展開時選取長勢基本一致幼苗供試[12 ]。

1.3? ?供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂12 g、蒸餾水1 000 mL。PSC培養(yǎng)液：蔗糖30 g、硫酸鎂0.5 g、蛋白胨10 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸亞鐵0.01 g、氯化鉀0.5 g、蒸餾水1 000 mL[2 ]。

1.4? ?試驗(yàn)方法

1.4.1? ? 毒素制備? ? 采用炭吸附法提取病原毒素[13 - 15 ]。將供試菌株在PDA平板上活化7 d，沿菌落邊緣打取菌餅（d=5 mm），轉(zhuǎn)接到盛有150mLPSC培養(yǎng)液的250 mL三角瓶內(nèi)，每瓶10片，置搖床25 ℃下160 r/min 12 h間歇搖動暗培養(yǎng)12d。培養(yǎng)液經(jīng)紗布過濾后8 000 r/min離心15 min，棄沉淀，留上清液即為培養(yǎng)濾液。在培養(yǎng)濾液中加5%的活性炭置5～6 ℃冰箱內(nèi)，12 h后用濾紙過濾炭末，然后按體積比1∶10的比例將炭末浸泡于45 ℃熱甲醇中1 h后過濾，濃縮甲醇提取液至淡黃色，再將濃縮物溶于50 mL熱甲醇中過濾。上清液加3倍體積的氯仿沉淀，移出黃色不溶物，剩下甲醇-氯仿溶解液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至黑色粘稠，即獲得粗毒素。用無菌蒸餾水將粗毒素稀釋30 倍即為粗毒素母液，再分別配制成0%、25%、50%、100%的粗毒素溶液待用。

1.4.2? ? 黃芪幼苗的處理? ? ?取 2～3葉期的黃芪幼苗洗凈根部，放入用無菌蒸餾水稀釋配制的0%、25%、50%、100%的粗毒素溶液中，置25 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在第0、 6、12、24 h 時取部分根系，以無菌蒸餾水浸泡的試管苗作為對照，處理好的根系組織保存于-20 ℃冰柜待用。 同時進(jìn)行植株外觀形態(tài)的觀察記載。

1.5? ?測定指標(biāo)與方法

黃芪幼苗根系脯氨酸含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白質(zhì)含量的測定分別參照張憲政主編的《作物生理研究法》規(guī)定的考馬斯亮藍(lán)法、蒽酮法、磺基水楊酸法[16 ]。

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?對黃芪幼根組織蛋白質(zhì)含量的影響

由圖1可見，經(jīng)毒素處理后黃芪幼根組織蛋白含量呈先升高后下降的趨勢。其中，用毒素脅迫處理6 h后，黃芪幼根蛋白質(zhì)含量略有升高。6～12 h，隨著脅迫時間的延長，除100%粗毒素溶液處理黃芪幼苗的可溶性蛋白質(zhì)仍在升高外，其余處理的可溶性蛋白含量均在降低。12～24 h，各處理可溶性蛋白含量均不同程度降低。這可能是由于植物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成過程受到抑制，但同時有一些被誘導(dǎo)出的新蛋白出現(xiàn)或原有蛋白質(zhì)含量的明顯增加;后又降低是由于隨著毒素作用時間的延長，破壞了植株體內(nèi)的正常代謝，進(jìn)而抑制了蛋白質(zhì)的合成。

2.2? ?對黃芪幼根組織可溶性糖含量的影響

由圖2可見，隨著毒素濃度的增加和脅迫處理時間的延長，黃芪幼苗根系的可溶性糖含量25%粗毒素溶液處理呈先降后升再降的趨勢;50%、100%濃度處理均呈先下降后上升的趨勢。在毒素處理的前期，隨著粗毒素液濃度越高可溶性糖含量下降的幅度越大。在毒素處理6 h時，幼苗根系的可溶性糖含量比毒素處理前下降了31.00%～73.67%，這可能是由于可溶性總糖主要參與植物體的呼吸代謝，毒素脅迫后植株體內(nèi)呼吸作用加強(qiáng)，消耗了可溶性糖。在粗毒素處理12 h后，除25%粗毒素溶液處理下降外，幼苗根系的可溶性糖含量開始緩慢升高，但始終明顯低于對照，這可能是因?yàn)橹仓隇榈挚苟舅氐膫ψ饔?，將大量的可溶性糖降解為小分子糖，為抗性代謝提供能量，并且還可以將可溶性糖作為基礎(chǔ)物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成為某些抗性物質(zhì)。

2.3? ?對黃芪幼根組織脯氨酸含量的影響

由圖3可見，毒素處理黃芪幼苗后，初期（0～6 h）幼苗根系的游離脯氨酸含量均快速增加，隨著粗毒素液濃度的增大而增雖，即脅迫初期脯氨酸含量與處理濃度呈正相關(guān)。中后期（6～24 h）脯氨酸含量變化開始呈現(xiàn)不同趨勢，隨著處理時間的延長，25%、50%、100%濃度處理脯氨酸含量增加緩慢，而對照脯氨酸含量開始持續(xù)降低。毒素脅迫從處理初期開始脯氨酸含量就明顯升高，這可能是由于植株感染病菌后，其體內(nèi)游離脯氨酸含量的大量累積是植株抵御病毒侵染的一種防御反應(yīng)，脯氨酸含量則隨著脅迫時間和毒素濃度的增加而增加，表現(xiàn)了黃芪幼苗對毒素敏感響應(yīng)。

3? ?結(jié)論與討論

研究表明，黃芪苗在經(jīng)過毒素處理后，可溶性蛋白含量均呈先升高后降低的趨勢。植物體內(nèi)可溶性蛋白含量升高可能是在受病菌侵染后形成了對病菌或毒素更穩(wěn)定、活性更強(qiáng)的同工酶，取代了對毒素或病菌不穩(wěn)定的酶，結(jié)果使它們在病害條件下發(fā)揮其特異功能。毒素處理后蛋白質(zhì)含量下降，可能是由于病原菌所誘導(dǎo)的抗病性生化反應(yīng)的啟動促使可溶性蛋白降解，蛋白質(zhì)分解加快而合成受到抑制，其分解產(chǎn)物有可能參與抗性物質(zhì)的合成?？扇苄缘鞍缀渴欠窨勺鳛轳Z化黃芪的一個生理指標(biāo)有待進(jìn)一步考證。

毒素處理前期時黃芪幼根可溶性糖含量大幅度下降，說明病原菌對黃芪幼苗表現(xiàn)出強(qiáng)致病性。脯氨酸含量則隨著脅迫時間和毒素濃度的增加而增加，說明植株體內(nèi)呼吸作用加強(qiáng)。參照臺蓮梅等[17 ]的研究可知，抗病品種和感病品種在毒素脅迫后可溶性糖變化趨勢不一，故可溶性糖含量的變化趨勢可以參考作為馴化黃芪和培育抗性品種的依據(jù)之一。脯氨酸是植物受害或在逆境時發(fā)生明顯變化的一種生化物質(zhì)，試驗(yàn)結(jié)果表明，脯氨酸含量隨粗毒素溶液濃度和脅迫時間的增加而增加，說明黃芪幼苗對毒素危害表現(xiàn)為敏感響應(yīng)。

蛋白質(zhì)是植物細(xì)胞中最重要的有機(jī)物質(zhì)之一，是細(xì)胞結(jié)構(gòu)中最重要的成分。植物在逆境條件下通過可溶性蛋白質(zhì)含量的變化，直接調(diào)控其適應(yīng)逆境的能力，在干旱、鹽漬、重金屬、病菌侵染等多種逆境脅迫下，植物體內(nèi)正常的蛋白質(zhì)合成過程會受到抑制，但同時會有一些被誘導(dǎo)出的新蛋白出現(xiàn)或原有蛋白質(zhì)含量明顯增加?？扇苄蕴窃谥参矬w內(nèi)主要參與呼吸代謝。在逆境條件下，植株體內(nèi)游離脯氨酸會增加，它可以清除活性氧自由基，因此對植物起到保護(hù)作用，說明毒素可引起葉片細(xì)胞內(nèi)游離脯氨酸含量的升高，使細(xì)胞束縛水的能力增強(qiáng)，促進(jìn)了蛋白質(zhì)的水合作用，保持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，從而維持細(xì)胞膜的正常生理活動，同時也可能表現(xiàn)了黃芪幼苗對致病菌毒素的敏感響應(yīng)。植株感染病菌后，體內(nèi)游離脯氨酸含量的大量累積是植株抵御病毒侵染的一種防御反應(yīng)，并且其增加幅度與抗性正相關(guān)，這為以后黃芪馴化培育抗性品種提供了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳? ?垣，朱? ?蕾，郭鳳霞，等.? 甘肅渭源蒙古黃芪根腐病病原菌的分離與鑒定[J].? 植物病理學(xué)報(bào)，2011，

41（4）：428-431.

[2] 丁文姣，李金花，柴兆祥.? 黃芪根腐病菌毒素濾液產(chǎn)生條件和生物活性的測定[J].? 中國中藥雜志，2009，

32（20）：2571-2575.

[3] 史建榮，王裕中，何晨陽，等.? 鐮刀菌單端孢霉烯毒素及其在植物病程中的作用[J].? 植物病理學(xué)報(bào)，1997，27（4）：298-302.

[4] 彭? ?杰，吳曉鵬，黃惠琴，等.? 鐮刀菌毒素研究進(jìn)展[J].? 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25（2）：25-27.

[5] 張?jiān)榔?? 鐮刀菌真菌毒素產(chǎn)生與調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展[J].? 生命科學(xué)，2011，23（3）：311-316.

[6]VERBRUGGEN N，HERMANS C. Proline accumulation in plants：are view[J].? Amino Acids，2008，35（4）：753-759.

[7] 王小華，莊南生. 脯氨酸與植物抗寒性的研究進(jìn)展[J].? 中國農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24（11）：398-402.

[8] 王麗媛，丁國華，黎? ?莉.? 脯氨酸代謝的研究進(jìn)展[J].? 哈爾濱師范大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報(bào)，2010，26（2）：84-89.

[9] 羅? ?丹，張喜春，田? ?碩.? 低溫脅迫對番茄幼苗脯氨酸積累及其代謝關(guān)鍵酶活性的影響[J].? 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（16）：90-95.

[10] 張? ?茹，魏兵強(qiáng)，王蘭蘭，等.? ?低溫脅迫對辣椒種子發(fā)芽及苗期 6 個生理指標(biāo)的影響[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2017（12）：26-30.

[11]丁文姣，徐? ?瑞，白? ?濱，等. 定西市黃芪根腐病優(yōu)勢病原菌生物學(xué)特性研究[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2018（3）：33-36.

[12] 賽鬧汪青，張牡丹，馬小俊，等.? 鎘脅迫對黃芪幼苗的生理學(xué)影響及凹凸棒粘土對鎘脅迫緩解作用的研究[J].? 中國中藥雜志，2018，43（15）：3115-3119.

[13] 臺蓮梅，許艷麗，高鳳昌.? 尖鐮孢毒素的初步研究[J].? 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，16（4）：9-12.

[14] 孫順娣.? 茄病鐮刀菌毒素的研究（1）[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，29（2）：140-144.

[15] 孫順娣.? 茄病鐮刀菌毒素的研究（2）[J].? 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，29（3）：245-249.

[16] 張憲政.? 作物生理研究法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1992：150-152;156-157;205-207.

[17] 臺蓮梅，許艷麗，閆鳳云.? 尖孢鐮刀菌毒素對大豆幼根生理生化的影響[J].? 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21（11）：193-196.

（本文責(zé)編：楊? ? 杰）