宗陽 孫明明 樂音子 顏帥

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1798-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.17

摘 要 目的：探討白術-枳實藥對治療慢性傳輸型便秘（STC）的作用機制。方法：借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP）檢索中藥白術、枳實的化學成分和作用靶點，通過UniProt、HCBI和PubMed等數(shù)據(jù)庫查詢靶點對應的基因，進而運用Cytoscape 3.2.1軟件構建化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡、蛋白相互作用核心網(wǎng)絡（PPICN）篩選出核心靶點，最后通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體（GO）功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析研究其作用機制。結果：共篩選出了26個活性化合物，其中化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡包含21個活性化合物和相應靶點142個，核心靶點涉及前列腺素內過氧化物合酶1（PTGS1）、PTGS2等。PPICN包含302個蛋白，關鍵蛋白涉及融合基因NTRK1、帕金森基因PARK2、抑癌基因TP53等。GO功能富集分析得到GO條目741個（P<0.05），其中生物過程條目457個、分子功能條目131個、與細胞組成相關的條目153個。KEGG通路富集篩選得到106條信號通路（P<0.05），涉及EB病毒感染通路、病毒致癌作用通路、絲裂原活化蛋白激酶通路等。結論：白術-枳實藥對通過多靶點、多通路來治療STC，這為進一步深入探討其作用的物質基礎以及作用機制提供了參考。

關鍵詞 白術-枳實藥對；慢性傳輸型便秘；網(wǎng)絡藥理學；靶點；基因；信號通路

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the mechanism of Atractylodes macrocephala-Citrus aurantium couplet medicine on slow transit constipation （STC）. METHODS： With the aid of traditional Chinese medicine system pharmacology platform （TCMSP）， chemical components and targets of A. macrocephala and C. aurantium were retrieved. The target genes were queried through UniProt， HCBI and PubMed databases. Cytoscape 3.2.1 software was used to establish compound-targets （genes） networks and protein-protein interaction core network （PPICN） so as to screen key target. The mechanism of its action was studied through gene ontology （GO） function enrichment analysis by DAVID database and based on the Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis. RESULTS： A total of 26 active compounds were screened. The compound-targets （genes） network contained 21 active compounds and 142 corresponding targets； key targets involved PTGS1， PTGS2， etc. PPICN contained 302 proteins， and key proteins involved fusion gene NTRK1， parkinson gene PARK2， antioncogene TP53， etc. The analysis of GO function enrichment obtained 741 Go item （P<0.05）， including 457 biological process items， 131 molecular function items and 153 cell composition related items. There were 106 signal pathways （P<0.05） in the KEGG pathway enrichment screening， involving EB virus infection pathway， viral carcinogenesis pathway， MAPK pathway and so on. CONCLUSIONS： A. macrocephala-C. aurantium couplet medicine treat STC through multiple target and multiple pathway. It provides reference for further study of their material basis and mechanism of action.

KEYWORDS Atractylodes macrocephala-Citrus aurantium couplet medicine； Slow transit constipation； Network pharmacology； Target； Gene； Signaling Pathway

慢性傳輸型便秘（Slow transit constipation，STC）是一種多發(fā)病，于1986年首次提出，是指由于大腸功能紊亂、傳導失常而導致的排便周期延長和排便困難，屬慢性、原發(fā)性、功能性、結腸性和傳輸緩慢性便秘[1]。但其發(fā)病機制和病因目前尚不清楚，可能與胃腸激素水平紊亂、胃腸動力不足、Cajal間質細胞（ICC）數(shù)量及形態(tài)變化、腸神經(jīng)系統(tǒng)（ENS）遞質含量、腸道菌群失衡等有關[2-5]。隨著飲食結構的變化，生活節(jié)奏的加快以及人類精神心理等因素的影響，STC的發(fā)病率顯著升高。臨床上主要采用緩瀉劑和促動力劑、生物反饋和手術等方法對STC進行治療，但治療滿意度不高，且副作用大，嚴重影響了人們的生活質量。

白術為菊科植物白術的根莖，自古以來就被譽為“健脾補氣第一要藥”，對脾胃系統(tǒng)的大部分疾病（包括功能性便秘）都能起到一定的治療作用，臨床上多用生白術治療STC，療效顯著[6]。枳實為蕓香科酸橙及其變種甜橙的干燥幼果，主要用于治療積滯內停、痞滿脹痛、大便不通等癥狀[7]。白術-枳實藥對治療胃腸運動功能障礙性疾病已有上千年歷史，最早見于《金匱要略》中的枳術湯，兩藥配伍，有健脾理氣通滯之功[8-9]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，白術-枳實藥對在促進胃腸動力方面明顯優(yōu)于單味藥組[10]。與西醫(yī)相比，中醫(yī)強調整體思想，辨證論治。網(wǎng)絡藥理學是基于系統(tǒng)生物學的理論，從而對生物系統(tǒng)進行網(wǎng)絡分析，選取特定信號節(jié)點（Nodes）進行多靶點藥物分子設計的新學科。網(wǎng)絡藥理學強調對信號通路的多途徑調節(jié)，提高藥物的治療效果，降低毒副作用，從而提高新藥臨床試驗的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費用。鑒于網(wǎng)絡藥理學可通過對多種復雜網(wǎng)絡及多水平相互連接的分析來闡述中藥多成分、多靶點、多通路的潛在的作用機制[11-12]，筆者擬通過應用網(wǎng)絡藥理學分析白術-枳實藥對治療STC的作用機制，為白術-枳實藥對治療STC提供細胞和分子層面的參考。

1 資料與方法

1.1 白術、枳實成分查詢

借助中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺[13]（TCMSP，網(wǎng)址為http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php），以“白術”“枳實”為關鍵詞檢索白術、枳實的化學成分。

1.2 活性化合物及靶標蛋白的篩選

口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）是藥物吸收、分布、代謝、排泄（ADME）中最重要的藥動學參數(shù)之一，其表示口服藥物的有效成分或活性基被吸收到達體循環(huán)并被吸收的速度與程度，OB值越高通常表示藥物的生物活性分子的類藥性（Drug likeness，DL）越好[14-15]。因此，借助TCMSP數(shù)據(jù)平臺，篩選出白術、枳實化合物中符合OB≥30%和DL≥0.15的化學成分作為活性成分及相關靶標蛋白。

1.3 靶標蛋白基因名的確定及化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡的構建

借助UniProt、HCBI和PubMed等數(shù)據(jù)庫查詢靶標蛋白對應的基因名，并用Cytoscape 3.2.1（網(wǎng)址為http：//www.cytoscape.org/）軟件構建化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡，分析化合物和靶點間的度（Degree）值。

1.4 蛋白相互作用的構建及其核心網(wǎng)絡的篩選

蛋白相互作用核心網(wǎng)絡（Protein-protein interaction core network，PPICN）是指從生物化學、信號轉導和遺傳網(wǎng)絡的角度研究化合物與疾病相關蛋白分子之間的相關性[16]。為了進一步了解白術-枳實靶點和疾病靶點在蛋白水平上的作用機制，本研究將篩選到的靶點上傳至在線網(wǎng)站STRING 10.5（網(wǎng)址為https：//string-db.org）上，獲取蛋白相互作用的關系，進而將得到的數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.2.1軟件篩選化合物與疾病之間的共有核心基因，進而得到PPICN圖。

1.5 核心靶點的通路分析

為了進一步了解上述篩選出的核心基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的白術-枳實配伍治療功能性便秘靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫[17]（網(wǎng)址為https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp），通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為其官方名稱（Official gene symbol），經(jīng)上述數(shù)據(jù)庫檢索和轉化操作，設定閾值P<0.05，進行基因本體（GO）功能富集分析和基于京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，并用在線繪圖網(wǎng)站Omishare Tools（網(wǎng)址為http：//www.omicshare.com/tools/index.php/）將其結果可視化。

2 結果

2.1 活性成分及靶標蛋白的篩選結果

通過TCMSP檢索到白術、枳實中共有化合物240個，其中110個來自白術，130個來自枳實。以OB≥30%和DL≥0.15為標準，篩選出活性化合物26個，其中7個來自白術，19個來自枳實，白術、枳實中含有的26個活性化合物的基本信息見表1。

2.2 化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡圖的構建結果

白術-枳實藥對化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡圖見圖1（圖中菱形節(jié)點代表白術的化合物分子，方形節(jié)點代表枳實的化合物分子，圓形節(jié)點代表藥物靶點，每條邊則表示化合物分子與靶點之間的相互作用關系，節(jié)點的大小與節(jié)點的Degree值呈正比）。

由圖1可知，化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡圖中共包括163個節(jié)點（21個化合物節(jié)點、142個靶點節(jié)點）和335條邊，表1的26個活性化合物中有5個未參與網(wǎng)絡構建。在網(wǎng)絡中，一個節(jié)點的Degree值表示網(wǎng)絡中與節(jié)點相連的路線的條數(shù)。根據(jù)網(wǎng)絡的拓撲學性質篩選Degree值較大的節(jié)點進行分析，這些連接化合物或靶點較多的節(jié)點在整個網(wǎng)絡中起到樞紐的作用，可能是關鍵的化合物或者靶點。在該網(wǎng)絡中，每個化合物平均與16個靶點相互作用，每個靶點平均與2.35個化合物相互作用，因此白術-枳實藥對中存在一個化合物與多個靶點之間的相互作用，同時也存在不同化合物共同作用于同一個靶點的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點之間共同作用的機制。從化合物的角度，有57%的化合物的作用靶點≥10個，其中作用靶點≥25個的化合物有5個；Degree值排名前5位的化合物分別是M23、M19、M21、M24、M8，分別能與57、36、34、31、28個靶點蛋白發(fā)生相互作用。從靶點的角度，Degree值排名前2位的是前列腺素內過氧化物合酶2（PTGS2）和PTGS1，分別能與16、11個化合物發(fā)生相互作用。

2.3 靶標蛋白基因名的確定及PPICN的構建結果

白術-枳實藥對與STC的PPICN圖見圖2（圖中節(jié)點表示蛋白，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系）。

由圖2可知，圖中共包含302個節(jié)點，9 816條邊，其中，Degree值大于100的節(jié)點占到38.74%，Degree 值排名前5位的節(jié)點是融合基因NTRK1、帕金森基因PARK2、抑癌基因TP53、APP、EGFR。

2.4 核心靶點的通路分析結果

DAVID中GO功能富集分析得到GO條目741個（P<0.05），其中生物過程（BP）條目457個，分子功能（CC）條目131個，細胞組成（MF）相關的條目153個。KEGG通路富集篩選得到106條信號通路（P<0.05），涉及EB病毒感染通路、病毒致癌作用通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等，白術-枳實藥對治療STC核心靶點KEGG富集分析的前30條通路圖見圖3。

3 討論

現(xiàn)代藥理學研究表明，白術主要含有揮發(fā)油、內酯類化合物、多糖、苷類等[18]，具有免疫調節(jié)、利尿、抗菌消炎等作用，對神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)也有一定作用，還能調節(jié)免疫功能[19]。枳實主要含有揮發(fā)油、生物堿類和黃酮類等[20]，具有調節(jié)胃腸動力、抗氧化、消炎鎮(zhèn)痛等作用，臨床上多用于消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等疾病的治療[21]。兩藥配伍，一升一降，一走一守，一急一緩，相互制約，相互為用，助其升清降濁之樞機，以達補而不滯、消不傷正、健脾強胃、消食化積、消痞除滿之功[22]。

從化合物-靶點（基因）網(wǎng)絡可以看出，白術-枳實藥對中白芷屬腦、獨活素、圣草酚、香蜂草苷和木犀草素等成分與靶點PTGS1和PTGS2的關系最為密切。PTGS又叫環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase，COX），是生物體內前列腺素合成起始步驟的關鍵酶，是生物活性脂類調節(jié)物包括前列腺素、血栓烷素和前列環(huán)素等各家族的前體。PTGS存在兩種同功酶[23]：結構型（PTGS1、COX-1）和誘導型（PTGS2、COX-2），兩者在表達水平、基因調控和分子特性上都有極顯著的區(qū)別。Shi XZ等[24]報道COX-2參與了梗阻后腸運動功能障礙的發(fā)生，在結腸不完全機械性腸梗阻大鼠模型上發(fā)現(xiàn)，梗阻近端擴張的腸環(huán)行平滑肌收縮活性顯著降低，COX-2 mRNA和蛋白的表達顯著上調；在拉伸試驗中體外腸平滑肌條和培養(yǎng)平滑肌細胞也出現(xiàn)了COX-2的表達水平升高；并且應用COX-2選擇性抑制劑NS-398可恢復腸平滑肌條和培養(yǎng)平滑肌細胞的收縮性；而且，COX-2基因缺陷小鼠梗阻后腸運動功能降低的程度顯著減弱。白術-枳實藥對是否通過調節(jié)COX從而治療STC需要進一步實驗驗證，但這也為后期研究提供了方向。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法對白術-枳實藥對的化學成分、作用靶點和治療STC的作用機制進行了探索性研究。研究結果初步驗證了該藥對的基本藥理學作用和相關機制，并為進一步深入探討作用機制奠定了良好基礎。從KEGG通路分析結果可以看出，白術-枳實藥對可以通過調節(jié)EB病毒感染通路、病毒致癌作用通路、MAPK通路等來治療STC，雖然與目前研究最多的干細胞因子（SCF）/SCF受體（c-Kit）[25]、一氧化氮（NO）/環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）/絲氨酸蛋白激酶（PKG）[26]、膠質細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）/GFRα1/神經(jīng)細胞黏附因子（NCAM）[27]、Ca2+/鈣調蛋白（CaM）/激球蛋白輕鏈激酶（MLCK）[28]、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/內皮型一氧化氮合酶（eNOS）[29]等典型的治療STC信號通路不大相同，但說明了白術-枳實藥對治療STC是以多靶點、多通路的形式來發(fā)揮作用的。鑒于網(wǎng)絡藥理學的局限性，課題組后期將圍繞物質基礎-藥效學評價-通路驗證等開展實驗研究，進一步為白術-枳實藥對治療STC以及后期的藥物開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。

參考文獻

[ 1 ] DINNING PG，DI LORENZO C. Colonic dysmotility in constipation[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25（1）：89-101.

[ 2 ] LING J，ZHANG W，XU B. Experimental study of Bisacodyl in the treatment of slow transit constipation model rats[J]. Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi，2016，19（12）：1365-1369.

[ 3 ] KNOWLES CH，F(xiàn)ARRRUGIA G. Gastrointestinal neuromuscular pathology in chronic constipation[J]. Best Pract Res Clin Gastroenterol，2011，25（1）：43-57.

[ 4 ] 王品，張有成.慢傳輸型便秘的病因及發(fā)病機制研究進展[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2012，12（30）：5994-5996.

[ 5 ] ZHAO Y，YU YB. Intestinal microbiota and chronic constipation[J]. Springerplus，2016.DOI：10.1186/s40064-016- 2811-1.

[ 6 ] 趙剛，姜亞欣，遲玉花.白術治療慢傳輸型便秘的研究進展[J].青島大學醫(yī)學院學報，2017，53（1）：124-126.

[ 7 ] 黃愛華，遲玉廣，曾元兒，等.枳實黃酮對功能性消化不良大鼠胃腸動力的影響[J].中藥新藥與臨床藥理，2012，23（6）：612-615.

[ 8 ] 李冀，孫琳林，柴劍波.淺談李東垣對枳術丸的運用[J].福建中醫(yī)藥，2005，36（6）：50-51.

[ 9 ] 陳雯雯，周峰峰，朱垚.枳術藥對臨床配伍運用[J].吉林中醫(yī)藥，2015，35（12）：1275-1277.

[10] 李冀，劉蔚雯，肖洪彬，等.枳術湯治療功能性消化不良的配伍研究[J].中華中醫(yī)藥學刊，2007，25（2）：199-202.

[11] 馮燕燕，謝媛媛，汪艷平，等.基于“藥物-靶點-通路”網(wǎng)絡的血必凈注射液治療膿毒癥分子調控機制[J].藥學學報，2017，52（4）：2666-2670.

[12] 唐策，文檢，楊娟，等.藏藥翼首草抗類風濕性關節(jié)炎活性成分靶點的網(wǎng)絡藥理學研究[J].中國藥房，2017，28（19）：556-562.

[13] RU J，LI P，WANG J，et al. TCMSP：a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J]. J Cheminform，2014，6（1）：13-18.

[14] AHMED SS，RAMAKRISHNAN V. Systems biological approach of molecular descriptors connectivity：optimal descriptors for oral bioavailability prediction[J]. PLoS One，2012.DOI：10.1371/journal.pone.0040654.

[15] URSU O，RAYAN A，GOLDBLUM A，et al. Understanding drug-likeness[J]. Wires Comput Mol Sci，2011，1（5）：760-781.

[16] 劉鑫馗，吳嘉瑞，張丹，等.基于網(wǎng)絡藥理學的參附湯作用機制分析[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（16）：211-218.

[17] 李曉燕，董姝，魏濱，等.六味地黃湯中藥成分-靶標-疾病網(wǎng)絡分析及效應機制預測[J].中國實驗方劑學雜志，2017，23（5）：189-195.

[18] 楊娥，鐘艷梅，馮毅凡.白術化學成分和藥理作用的研究進展[J].廣東藥學院學報，2012，28（2）：218-221.

[19] 凌宗全.白術化學成分及藥理作用研究進展[J].內蒙古中醫(yī)藥，2013，32（35）：105-106.

[20] 王紅勛.枳實與枳殼的現(xiàn)代藥理與臨床應用研究[J].中國衛(wèi)生標準管理，2014，5（16）：39-40.

[21] 張霄瀟，李正勇，馬玉玲，等.中藥枳實的研究進展[J].中國中藥雜志，2015，40（2）：185-190.

[22] 呂景山.施今墨對藥[M]. 3版.北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：158.

[23] 田亞汀，張玉平，田小菲，等.環(huán)氧化酶在腸道運動功能障礙中的作用[J].中國老年學雜志，2015，35（4）：1124-1127.

[24] SHI XZ，LIN YM，POWELL DW，et al. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction：role of stretch-induced COX-2[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2011，300（1）：G99-G108.

[25] JIN J，LI Y，WANG Y，et al. SCF/C-KIT signaling modulates tryptase expression in acute myeloid leukemia cells[J]. Int J Hematol，2014，99（6）：750-757.

[26] LEE S，GIM H，SHIM JH，et al. The traditional herbal medicine，Ge-Gen-Tang，inhibits pacemaker potentials by nitric oxide /cGMP dependent ATP-sensitive K（+） channels in culturedinterstitial cells of Cajal from mouse small intestine[J]. J Ethnopharmacol，2015.DOI：10.1016/j.jep. 2015.05.025.

[27] FAN YH，XU GP，F(xiàn)ENG W. Effects of zhizhu tongbian decoction on the colon ink propelling rate，GDNF，and NOS mRNA expression in rats with slow transit constipation[J]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2012，32（4）：486-489.

[28] 陳斌.開胃進食湯超微配方顆粒調節(jié)胃腸動力作用的臨床及實驗研究[D].長沙：湖南中醫(yī)藥大學，2007.

[29] 李旻昊，張國志，袁梅，等.慢傳輸型便秘大鼠胃腸組織中PI3K/AKT/eNOS信號通路相關標志物的表達變化及意義[J].山東醫(yī)藥，2015，55（19）：27-29.

（收稿日期：2018-01-02 修回日期：2018-03-09）

（編輯：林 靜）