曾貴榮 吳莉峰 譙志文 李慶利 劉學(xué)武 周年華 潘任桃 石永忠 李里 徐永興 周志容 唐萍 劉新民 陳曉雪

中圖分類號 R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）19-2631-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.19.09

摘 要 目的：研究巴戟口服液對少、弱精癥模型小鼠的生精作用和對精子活力的影響，并探討其作用機(jī)制。方法：采用腹腔注射環(huán)磷酰胺建立小鼠少、弱精癥模型。選擇造模成功的小鼠50只，隨機(jī)分為模型對照組、復(fù)方玄駒膠囊組（陽性對照，0.4 g/kg）和巴戟口服液低、中、高劑量組（3.9、7.8、15.6 mL/kg），每組10只；另取10只正常小鼠作為正常對照組。各給藥組小鼠每天灌胃相應(yīng)藥物1次，正常對照組和模型對照組小鼠灌胃蒸餾水，給藥體積均為20.0 mL/kg，均連續(xù)給藥28 d。給藥結(jié)束后，采用精子分析儀檢測小鼠精液中精子總數(shù)、精子密度和精子活力，酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組小鼠血清中睪酮和睪丸組織中堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）含量，蘇木精-伊紅染色后在顯微鏡下進(jìn)行睪丸組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：與正常對照組比較，模型對照組小鼠精液中精子總數(shù)、精子密度、精子活力和血清中睪酮含量以及睪丸組織中bFGF含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）；顯微鏡下可見，睪丸組織生精上皮層數(shù)和生精細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.01），生精細(xì)胞排列疏松。與模型對照組比較，復(fù)方玄駒膠囊組小鼠精液中精子活力和巴戟口服液各劑量組小鼠精液中精子總數(shù)、精子活力以及巴戟口服液高劑量組小鼠精液中精子密度顯著升高（P<0.05或P<0.01），各給藥組小鼠血清中睪酮和睪丸組織中bFGF含量也均顯著升高（P<0.05或P<0.01）；顯微鏡下可見，各給藥組小鼠睪丸生精上皮層數(shù)顯著增加（P<0.05或P<0.01）且厚薄均勻，生精細(xì)胞顯著增加（P<0.01）且排列整齊。結(jié)論：巴戟口服液對環(huán)磷酰胺致少、弱精癥模型小鼠具有生精作用，可明顯提高精子活力；其機(jī)制可能與增加血清中睪酮和睪丸組織中bFGF含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 巴戟口服液；少、弱精癥模型；睪酮；堿性成纖維細(xì)胞因子；小鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effect of Baji oral solution on spermatogenesis effect and sperm motility in cyclophosphamide- induced oligospermia and asthenospermia model mice， and to investigate its mechanism. METHODS： The oligospermia and asthenospermia model was induced by intraperitoneal injection of cyclophosphamide. After modeling， 50 mice were randomly divided into model control group， Compound xuanju capsule group （positive control， 0.4 g/kg）， Baji oral solution low-dose， medium-dose and high-dose groups （3.9， 7.8， 15.6 mL/kg）， with 10 mice in each group. Other 10 normal mice were included in normal control group. Administration group was given relevant medicine intragastrically once a day； normal control group and model control group were given distilled water， the volume of administration was 20.0 mL/kg， for consecutive 28 d. After medication， spermatozoon analyzer was used to detect total number， density and activity of sperm； ELISA assay was adopted to detect content of testosterone in serum and the content of bFGF in testicles of mice； histopathological examination of testicles was observed under microscope after HE staining. RESULTS： Compared with normal control group， total number， density and activity of sperm， serum content of testosterone and the content of bFGF in testicles were decreased significantly in model control group （P<0.05 or P<0.01）. Under microscope， the number of spermatogenic epithelium and spermatogenic cells in testis were decreased significantly （P<0.01）， and spermatogenic cells were loosely arranged. Compared with model control group， the activity of sperm in Compound xuanju capsule group， total number and activity of sperm in Baji oral solution groups and the density of sperm in Baji oral solution high-dose group were alse increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. The serum content of testosterone and the content of bFGF in testicles were alse increased significantly in administration group （P<0.05 or P<0.01）. Under microscope， the number of spermatogenic epithelium in testis was increased significantly with uniform thickness （P<0.05 or P<0.01）， and the number of spermatogenic cells was increased significantly （P<0.01） and arranged orderly. CONCLUSIONS： Baji oral solution shows spermatogenic effect on cyclophosphamide-induced oligospermia and asthenospermia model mice and improves sperm motility， the mechanism of which may be associated with increasing serum content of testosterone and the content of bFGF in testicles.

KEYWORDS Baji oral solution； Oligospermia and asthenospermia model； Testosterone； bFGF； Mice

少、弱精癥是影響男性生育能力的一種常見疾病，已逐漸成為困擾全球男性的重要疾病之一。近年來，有關(guān)治療少、弱精癥的藥物研究進(jìn)展迅速，尤其是中藥在治療少、弱精癥方面顯示出其獨(dú)特的優(yōu)勢[1]。巴戟口服液是由巴戟天、何首烏、杜仲、肉蓯蓉、續(xù)斷、仙茅、金櫻子等16味中藥制成的紅棕色液體制劑，氣微香，味甜，具有補(bǔ)腎壯腰、固精止遺、調(diào)經(jīng)的功效，用于腎陽不足、命門火衰而致的神疲不振以及陽痿不舉或早泄、腰膝軟弱和遺精滑泄、精冷而稀等證[2]。中醫(yī)認(rèn)為，腎陽不足、腎氣虧虛為少精癥的發(fā)病機(jī)制，這與巴戟口服液的治療功效相符[3-4]。目前，臨床上尚未有巴戟口服液對少、弱精癥治療的研究，盡管有動物實(shí)驗(yàn)表明巴戟口服液對去勢大鼠血清中睪酮含量及交配能力有改善作用[5]，但巴戟口服液對少、弱精癥動物影響及作用機(jī)制尚不明朗。因此，筆者初步研究巴戟口服液對少、弱精癥模型小鼠的生精作用，并初步探討其作用機(jī)制，為擴(kuò)大其臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

TOX IVOS型全自動精子分析儀（西安百德儀器設(shè)備有限公司）；B203LED型生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；RM2235型石蠟切片機(jī)、EG1150H+C型組織包埋機(jī)、DFC 420C型病理成像系統(tǒng)（德國Leica公司）。

1.2 藥品與試劑

巴戟口服液（重慶希安爾藥業(yè)有限公司，批號：170601，規(guī)格：10 mL/支）；復(fù)方玄駒膠囊（浙江施強(qiáng)制藥有限公司，批號：20170501，規(guī)格：0.42 g/粒）；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇凱迪醫(yī)藥有限公司，批號：17032425，規(guī)格：0.1 g/瓶）；睪酮、堿性成纖維細(xì)胞因子（bFGF）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司，批號：170514、170602）。

1.3 動物

SPF級ICR小鼠68只，♂，體質(zhì)量18.2～21.5 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（湘）2011-0003，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（湘）2015-0016。購入后將小鼠飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，飼養(yǎng)期間控制環(huán)境溫度為20～26 ℃、濕度為40%～70%。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

取54只小鼠，腹腔注射環(huán)磷酰胺2.0 mg/kg，每日1次，連續(xù)5 d，建立小鼠少、弱精癥模型[6-7]。另取14只小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉注射液（20.0 mL/kg），作為正常對照組。造模后，分別隨機(jī)從正常對照組和造模小鼠中選4只，采集精液，進(jìn)行精子分析，若造模小鼠精子密度、精子活力及精子活動度均顯著低于正常對照組小鼠，且精子畸形率顯著高于正常對照組小鼠，則表明造模成功[6]。取造模成功的50只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型對照組、復(fù)方玄駒膠囊組（陽性對照，0.4 g/kg，臨床用量的等效劑量）和巴戟口服液低、中、高劑量組（3.9、7.8、15.6 mL/kg，分別為臨床用量的0.5、1、2倍等效劑量），每組10只。正常對照組和模型對照組小鼠灌胃蒸餾水，各給藥組小鼠分別灌胃相應(yīng)藥液，給藥體積均為20.0 mL/kg，每日1次，均連續(xù)給藥28 d。

2.2 血清中睪酮含量測定

末次給藥后，小鼠禁食不禁水，12 h后眼眶采血，將血樣以3 000 r/min離心10 min，分離血清，采用ELISA法測定各組小鼠血清中睪酮含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 精液中精子總數(shù)、精子密度和精子活力測定

取小鼠附睪組織，分離出精液，取10 ?L精液置于2.0 mL的EP管內(nèi)，加生理鹽水0.1 mL稀釋，用全自動精子分析儀進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)精子總數(shù)、精子密度和精子活力[以精子存活率（%）表示]。

2.4 睪丸組織中bFGF含量測定

取左側(cè)睪丸組織，稱質(zhì)量后加入生理鹽水（1 ∶ 9， g ∶ mL），低溫條件下制成10%勻漿液。將勻漿液以3 000 r/min離心10 min，取上清，采用ELISA法檢測睪丸組織中bFGF含量，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 睪丸組織病理學(xué)檢查

取右側(cè)睪丸組織，10%甲醛固定，將固定后組織橫切，取0.5 cm組織塊石蠟包埋后進(jìn)行5 ?m切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下每張切片隨機(jī)選取5個視野進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)圓形曲細(xì)精管生精上皮層數(shù)和生精細(xì)胞數(shù)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠精液中精子總數(shù)、精子密度和精子活力測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組小鼠精子總數(shù)、精子密度和精子活力顯著降低（P<0.05或P<0.01）；與模型對照組比較，復(fù)方玄駒膠囊組小鼠精液中精子活力和巴戟口服液低、中、高劑量組小鼠精液中精子總數(shù)、精子活力以及巴戟口服液高劑量組小鼠精液中精子密度顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠精液中精子活動度情況見圖1，精子總數(shù)、精子密度和精子活力測定結(jié)果見表1。

3.2 各組小鼠血清中睪酮含量的影響測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清中睪酮含量顯著降低（P<0.01）；與模型對照組比較，各給藥組小鼠血清中睪酮含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組小鼠血清中睪酮含量測定結(jié)果見表2。

3.3 各組小鼠睪丸組織中bFGF含量測定結(jié)果

與正常對照組比較，模型對照組小鼠睪丸組織中bFGF含量顯著降低（P<0.01）；與模型對照組比較，各給藥組小鼠睪丸組織中bFGF含量顯著升高（P<0.01）。各組小鼠睪丸組織中bFGF含量測定結(jié)果見表3。

3.4 各組小鼠睪丸組織病理學(xué)觀察結(jié)果

正常對照組小鼠睪丸組織生精上皮層次清晰，精子細(xì)胞排列緊密。模型對照組小鼠睪丸組織生精上皮層數(shù)和生精細(xì)胞數(shù)量均顯著減少（P<0.01），且生精細(xì)胞排列疏松。復(fù)方玄駒膠囊和巴戟口服液各劑量組小鼠睪丸組織生精上皮厚薄均勻，層數(shù)均顯著增加（P<0.05或P<0.01）；生精細(xì)胞排列整齊，數(shù)量也顯著增加（P<0.01）。各組小鼠睪丸組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖2，生精上皮層數(shù)和生精細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

4 討論

少、弱精癥是造成男性不育或生育力下降的主要原因之一。中醫(yī)認(rèn)為，精是構(gòu)成人體的最基本物質(zhì)，也是人體各種機(jī)能活動的物質(zhì)基礎(chǔ)。男性不育的病因與腎關(guān)系最為密切。腎氣充沛、精血旺盛，則精液充足、精子活潑靈動；陽氣不足，則腎精不能化生，精子活力下降，精子數(shù)量及精液量生成不足[8-10]。目前，西醫(yī)治療主要是促進(jìn)睪丸的生精功能和提高精子的活力，然而在提升睪丸生精功能的同時對機(jī)體有一定副作用。

bFGF具有促進(jìn)來源于中胚層細(xì)胞增殖并調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的作用[11-13]，能夠促進(jìn)睪丸生精細(xì)胞分裂增殖，提高精液質(zhì)量及生育能力[14-15]。男性生殖器官來源于中胚層，且睪丸生精細(xì)胞增殖活躍，bFGF對睪丸生精作用主要表現(xiàn)在直接促進(jìn)生精細(xì)胞分裂增殖、改善生精環(huán)境以及對生殖激素的影響。睪丸的生精功能與生殖激素[催乳素（PRL）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）、睪酮 ）]水平密切相關(guān)，睪丸生精功能是FSH作用于支持細(xì)胞與LH通過刺激間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮相互協(xié)同作用的結(jié)果[16]。

在臨床研究中，對于少、弱精癥治療的中藥復(fù)方較少，復(fù)方玄駒膠囊具有溫腎、壯陽、益精的功效，用于腎陽虛型、癥見神疲乏力、精冷滑泄、性欲低下、功能性勃起功能障礙等癥的治療，對少、精弱精癥患者的精子質(zhì)量等有著明顯的改善作用[17]，屬臨床治療的常用藥。因此，本研究采用復(fù)方玄駒膠囊為陽性對照藥。在本研究中，少、弱精癥模型小鼠睪丸組織中bFGF和血清睪酮含量顯著降低，而巴戟口服液能明顯升高小鼠血清中睪酮含量和睪丸組織bFGF含量，增加精子密度，提高精子活力，增加睪丸組織生精上皮層數(shù)和生精細(xì)胞數(shù)量。

綜上所述，巴戟口服液可顯著提高環(huán)磷酰胺致少、弱精癥模型小鼠的精子密度和精子活力，其機(jī)制可能與增加血清中睪酮和睪丸組織中bFGF含量有關(guān)。本研究結(jié)果為巴戟口服液用于治療少、弱精癥提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

（致謝：感謝湖南省人民醫(yī)院男科實(shí)驗(yàn)室提供的實(shí)驗(yàn)幫助?。?/p>

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（收稿日期：2018-05-21 修回日期：2018-08-02）

（編輯：林 靜）