王立 張坤 鄒燁 張新笑 李鵬鵬 王道營 徐為民

摘要： 以雞肝為原料，采用NaOH溶劑為提取劑，采用超聲輔助法提取雞肝蛋白，并與常規(guī)水浴提取法得到的雞肝蛋白作比較，通過紫外吸收光譜、熒光光譜、傅里葉紅外光譜、掃描電鏡研究超聲輔助提取對雞肝蛋白結構的影響，結果表明，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取雞肝蛋白的得率和總蛋白質含量分別提高了58.1%和9.6%，超聲輔助提取導致雞肝蛋白結構發(fā)生伸展，蛋白結構發(fā)生改變。與常規(guī)水浴提取相比，超聲輔助提取可顯著提高其凝膠性能，超聲輔助提取并沒有改變雞肝蛋白的亞基組成，但超聲輔助提取的雞肝蛋白的溶解度、持水性及吸油性、起泡性及起泡穩(wěn)定性和乳化性及乳化穩(wěn)定性均得到顯著提高（P<0.05），因此超聲輔助提取能顯著提高雞肝蛋白的功能特性，該研究結果為雞肝蛋白的深加工提供了一定的科學依據(jù)和理論基礎。

關鍵詞：雞肝蛋白;超聲輔助提取;蛋白質結構;功能特性

雞肝為雉科動物家雞的肝臟，占雞體質量的2.0%～2.5%，是一種營養(yǎng)豐富、附加值較高的肉制品加工副產(chǎn)物之一。雞肝富含蛋白質、脂肪、糖類，同時還含有鈣、鐵、磷、鐵、鋅、硒、VA、VH2等營養(yǎng)元素，其中VA含量遠超蛋、奶、肉等食品。雞肝中硒等微量元素是重要的營養(yǎng)物質，具有增強機體免疫力、抗氧化、抑制腫瘤等重要功能。雞肝蛋白是一類以共價鍵連接而成的生物大分子，在生物的新陳代謝中具有重要功能。

超聲輔助提取作為一種新型的非熱物理加工技術，適用于不同來源的生物活性提取，特別是在蛋白提取等食品領域具有廣泛的應用前景，它在促進食品中有效成分的提取具有獨特的優(yōu)勢，具有溶劑用量少、蛋白質提取率高等優(yōu)點。通過超聲效應，進一步改變其蛋白質內部分子結構，如維持蛋白質結構的化學鍵——氫鍵、范德華力、疏水性等，從而改變其溶解性、持水性、持油性、乳化性、起泡性等功能特性，雖然雞肝含優(yōu)質完全蛋白質，但到目前為止，對雞肝進行深加工提取雞肝分離蛋白質，進一步研究雞肝蛋白的結構特征及功能特性的研究報道較少。因此，本研究采用超聲輔助堿法提取雞肝蛋白，進一步研究其結構特征和功能特性，為充分利用肉制品加工副產(chǎn)物雞肝蛋白在食品等領域的潛在價值提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料：雞肝蛋白為實驗室自制，試劑：凝固酶、Marker標品由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)，考馬斯亮藍由南京建成生物科技有限公司生產(chǎn)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

UV-6100型紫外分光光度計購自上海美普達儀器有限公司，F(xiàn)L-4600熒光分光光度計購自日本日立高新技術公司，Zeta電位分析儀購自上海麥克默瑞提克儀器有限公司，傅里葉變換紅外光譜儀購自天津港東科技發(fā)展股份有限公司，EVO-LS10掃描電子顯微鏡購自德國蔡司股份有限公司，Uncen MR臺式冷凍離心機購自英國Hero lab公司，M124A電子天平購自意大利BEL公司，便攜式pH計購自美國OUAUS公司，HJ-8（DF-1）集熱式磁力攪拌器購自常州國華電器有限公司，高速均質機購自德國IKA公司，AR2000流變儀購自英國TA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞肝蛋白的提取工藝 常規(guī)水浴提?。盒迈r鴨肝（10g）一勻漿（10000 r/min，30s）一異丙醇脫脂（10%，靜置12h）一離心（5000g，15min）一干燥一水浴提取[時間：40 min，溫度：40℃，料液比1∶60（體積比），NaOH l%]一離心（5000g，15min）一取上清液一測定常規(guī)水浴提取雞肝蛋白含量（考馬斯亮藍法）一透析一真空冷凍干燥。

超聲輔助水浴提?。盒迈r雞肝（2g）一勻漿（10000 r/min，30s）一異丙醇脫脂（10%，靜置12h）一離心（5000g，15min）一干燥一超聲輔助水浴提取[超聲功率：150 W，超聲時間：40 min，溫度：40oC，料液比1∶60（體積比），NaOH l%]一離心（5000g，15min）一取上清液一測定超聲輔助提取雞肝蛋白含量（考馬斯亮藍法）一透析一真空冷凍干燥。

1.3.2 雞肝蛋白提取率的測定 雞肝蛋白得率=所提雞肝蛋白總量/原料中粗蛋白總量×100%

1.3.3 雞肝蛋白的結構測定

1.3.3.1 雞肝蛋白的紫外可見分光光譜測定使用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制1.0 mg/ml常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白溶液，在25℃下使用紫外可見分光光度計在波長200～700 nm對2種蛋白溶液進行分析測定。紫外分光光度計掃描條件：石英比色皿1cm，掃描速度10 nm/min，步長lnm。0.01%的磷酸鹽緩沖液的光譜作為空白光譜，雞肝蛋白溶液的光譜與磷酸鹽緩沖液光譜的差譜即為雞肝蛋白的紫外光譜。

1.3.3.2 雞肝蛋白的熒光光譜測定 使用10mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）制備0.2 mg/ml常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白溶液。在25℃下使用熒光分光光度計對2種溶液進行分析。使用光程為lcm的石英比色皿。激發(fā)波長為280nm，發(fā)射光譜范圍為300～ 460 nm。激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度為2.5 nm，掃描速度為1200 nm/min。

1.3.3.3 雞肝蛋白的凝膠電泳測定（SDS-PAGE）制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白上清液與上樣緩沖液進行混合，沸水浴10min，于12000 g離心3 min。取15μl的上清液上樣。采用分子量蛋白Marker（10—180000）作為對照，加入1L的電泳緩沖液，在電泳電流為16mA下進行15min后再在32mA下進行th。電泳結束后，采用考馬斯亮藍R-250染色15min，通過脫色液進行脫色，直至可以清楚辨別條帶為止。

1.3.3.4 雞肝蛋白的傅里葉紅外光譜測定 使用0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制0.2mg/ml常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白溶液。在25℃下使用傅里葉紅外光譜儀在波數(shù)525—4000cm-1內對2種蛋白溶液進行掃描。掃描條件：加樣量0.5ml，分辨率4cm-l，掃描次數(shù)7209，磷酸鹽緩沖液紅外光譜作為空白，蛋白溶液與空白光譜的差值即為雞肝蛋白溶液的紅外光譜圖。

1.3.3.5 雞肝蛋白的流變特性測定 采用AR2000流變儀，選擇直徑40 mm.不銹鋼平板測量系統(tǒng)，平板間距l(xiāng)nm，溫度25℃，剪切速率20～200s-1，記錄其剪切黏度及剪切應力的變化情況。

將凝固酶添加到常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白溶液中以實現(xiàn)凝膠化。在加入凝固酶之前，先加入0.02% CaCl，。在30 ℃下加入凝固酶凝膠后，將凝膠樣品（20ml）置于同心圓筒中。于流變儀中記錄樣品的儲能模量（G）和損耗模量（G”），并將儲能模量數(shù)據(jù)用于凝膠化評估，試驗平行做3次。

1.3.3.6 雞肝蛋白的掃描電鏡觀察 將常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白采用液氮吹干，采用掃描電鏡（SEM）觀察其蛋白表面微觀結構。掃描電鏡條件：加速電壓10 kV。

1.3.4 雞肝蛋白的功能特性測定

1.3.4.1 雞肝蛋白的溶解性測定為了測定其溶解度，將10mg樣品溶于8ml蒸餾水中，并用lmol/LHC1或lmol/L NaOH調節(jié)pH分別至2、4、6、8、10和12，并將混合物于室溫下攪拌30 min。在5 000 g離心15min，通過蒸餾水將溶液體積預先調節(jié)至與樣品溶液相同的pH。采用考馬斯亮藍法測定其上清液中的蛋白質含量。蛋白質溶解度計算如公式為：溶解度=上清液蛋白質含量/總蛋白質含量×100%。

1.3.4.2 雞肝蛋白的持水性測定稱取100mg常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白于10ml離心管中，加入5ml去離子水充分混勻，于室溫下靜置1h，5000g離心10min.去除上清液，將離心管倒置于濾紙上以去除多余水分，準確稱取沉淀質量。以每克樣品吸附水的質量數(shù)表示持水性。持水性計算公式為：持水性=（沉淀物總質量一樣品質量）/樣品質量×100%。

1.3.4.3 雞肝蛋白的吸油性測定稱取100 mg常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白于10 ml離心管中，加入5ml色拉油并充分混勻，于室溫下靜置1h，5000g離心10 min，去除上層未吸附的色拉油后準確稱質量，以每lg蛋白質樣品吸附油的質量數(shù)表示吸油性（OHC）。吸油性計算公式為：吸油性=（沉淀物質量一樣品質量）/樣品質量×100%。

1.3.4.4 雞肝蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性的測定制備0.1%、0.5%、1.0%及2.0%的20ml常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白溶液至100ml量筒內，測定此時溶液的體積（vo）。然后將溶液在高速均質機下以12000g均質30 s后立即轉移到量筒內，測量此時量筒內的樣品體積（VT），靜置60min測量此時量筒內的樣品體積（Vt）。起泡性（FC）和起泡穩(wěn)定性（FS）計算公式分別為：起泡性=VT/VOxl00%;起泡穩(wěn)定性=Vt/Voxl00%。式中：VT是均質后的總體積;v0是均質前的原始體積;vt是在室溫下靜置60mm后的總體積。

1.3.4.5 雞肝蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定通過分光光度法測定常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白的乳化性，采用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液配制雞肝蛋白溶液的質量比為0.15，加人大豆油，混合液總體積為40 ml。采用高速均質機將混合液于10000 g下均質l min，乳狀液待用。取底部乳狀液50μl，用0.1%十二烷基硫酸鈉溶液將雞肝蛋白稀釋至100倍置于比色皿中，以十二烷基硫酸鈉溶液作為空白，于500 nm處測定吸光度Ao，10min后，測吸光度A10，乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI計算公式分別為：稀釋倍數(shù);

式中：Ao為0 min時測定的吸光度;A10為10 min時測定的吸光度;C為雞肝蛋白的質量濃度;β為大豆油的質量比（0.15）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理，結果以平均值±標準差表示，Turkey檢驗用于兩組間的數(shù)據(jù)分析，P<0.05表示兩組之間具有顯著性差異，采用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 雞肝蛋白提取率

由表1可知，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白的得率和總蛋白質含量分別提高了58.1%、9.6%，這可能是由于超聲提取導致雞肝蛋白細胞壁破裂，加快了溶劑的滲透效率，從而提高了蛋白質提取率。Zou等采用超聲輔助提取鴨肝蛋白，得率和總蛋白質含量分別提高了67.7%、4.6%，表明采用超聲提取可顯著提高蛋白質提取率和總蛋白質含量。

2.2 雞肝蛋白結構

2.2.1 雞肝蛋白的紫外可見光譜蛋白質的近紫外吸收光譜（250—350 nm）與它的芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸等）密切相關，波長250—350 nm處的紫外吸收光譜圖可提供蛋白質分子在溶液中的構象變化。由圖1可知，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，采用超聲輔助提取的雞肝蛋白，紫外吸收光譜發(fā)生明顯位移變化，并且吸收強度具有不同程度的增加趨勢。在波長285nm處，常規(guī)水浴提取和超聲輔助提取的雞肝蛋白具有明顯的特征吸收峰，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白紫外吸收強度顯著增大，這可能是由于超聲處理后導致其分子內部的疏水性基團暴，使其不飽和基團增加，這與金建采用雙頻超聲預處理玉米醇溶蛋白的結果是一致的，表明超聲提取改變了雞肝蛋白的內部結構，使其紫外吸收強度明顯提高。

2.2.2 雞肝蛋白的熒光光譜 熒光光譜是表征蛋白質分子構想發(fā)生變化的另一手段，通過測定蛋白質中部分能產(chǎn)生熒光的氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）殘基來推測其蛋白質構想的變化趨勢。由圖2可知，在波長330～340 nm處，常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白和超聲輔助提取的雞肝蛋白的熒光強度最高。與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，采用超聲輔助提取的雞肝蛋白熒光強度顯著提高，這可能是由于經(jīng)超聲處理后，雞肝蛋白內部結構發(fā)生伸展，破壞了其分子間作用力，導致部分色氨酸殘基暴露，從而提高了其熒光強度。任曉鋒通過雙頻超聲預處理玉米醇溶蛋白后其熒光強度明顯提高。表明采用超聲輔助提取導致雞肝蛋白二級結構發(fā)生變化，這可能與超聲處理時產(chǎn)生的剪切力有關。

2.2.3 雞肝蛋白的凝膠電泳 由圖3可知，常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白和超聲輔助提取的雞肝蛋白的所有條帶是完整的，沒有出現(xiàn)額外碎條帶，這與Zhang等研究采用超聲處理后花生蛋白凝膠電泳沒有發(fā)生變化是一致的，說明超聲輔助提取并沒有改變雞肝蛋白的亞基組成。

2.2.4 雞肝蛋白的傅里葉紅外光譜 蛋白質的肽鍵是一種酰胺鍵，它在紅外區(qū)有特征吸收峰，其中酰胺I帶對蛋白質結構分析最為重要，它與蛋白質二級結構具有一定的對應關系，酰胺I帶具有一個最大吸收峰（波數(shù)為l648 cm-1），該峰對蛋白質二級結構變化最為敏感，因此可通過紅外光譜對雞肝蛋白二級結構進行分析。由圖4可知，常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白和超聲輔助提取的雞肝蛋白在波數(shù)為1500-1700cm-1具有相同特征的最大吸收峰，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白的二級結構變化更為顯著，這與任曉鋒采用雙頻超聲處理玉米醇溶蛋白其波數(shù)在1648cm-l具有相同特征最大吸收峰是一致的，表明采用超聲處理對雞肝蛋白的二級結構產(chǎn)生了重要影響。

2.2.5 雞肝蛋白的流變特性 流變性能與蛋白質的功能性質密切相關，如：凝膠能力、起泡能力影響著食品的品質。由圖SA可知，雞肝蛋白呈現(xiàn)假塑形流體（n<1），即黏度隨剪切速率的增大而減小。在20～200 s-1的高剪切速率下，與常規(guī)水浴提取相比，超聲提取能顯著增加雞肝蛋白的流變指數(shù)n值，這與胡昊采用高場強超聲波處理大豆蛋白的流變性變化是一致的，這可能是由于超聲波的空穴作用加速雞肝蛋白分子運動使其結構發(fā)生變化，從而導致其流變性能發(fā)生改變。由圖SB可知，常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白和超聲輔助提取的雞肝蛋白的儲能模量G隨溫度的升高而增大。與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白具有更高的彈性，這可能是由于超聲處理能促使雞肝蛋白形成均一、致密、高強度的凝膠網(wǎng)絡結構。

2.2.6 雞肝蛋白的表面微觀結構 由圖6可知，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白致密的網(wǎng)狀結構相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白出現(xiàn)很多微孔，結構變得疏松。這些微觀結構的變化可能是由于超聲的空化效應使其形成的局部微射流及震蕩波所產(chǎn)生的剪切力破壞了雞肝蛋白分子間氫鍵和范德華力，從而使更多的巰基和疏水性基團暴露于其蛋白質表面，導致其粒徑減小，蛋白質結構遭到破壞，使得蛋白質聚集體發(fā)生分散，形成更加寬松的層狀結構，這與金建采用雙頻超聲處理玉米醇溶蛋白后表面微觀結構變得疏松是一致的，采用超聲處理對雞肝蛋白結構產(chǎn)生重要影響，導致其表面微觀結構發(fā)生顯著變化。

2.3 雞肝蛋白的功能特性

2.3.1 雞肝蛋白的溶解性 溶解度是衡量蛋白質變性和聚集的重要指標之一，是蛋白質的重要功能性質之一。與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白溶解度顯著提高（圖7）。這是由于超聲處理引起蛋白質結構改變，形成可溶性蛋白質聚集物，蛋白質粒徑減小，從而增加了蛋白質與水的相互作用。于雷等采用超聲波輔助酶法提高了提取的米糠蛋白的溶解度。雞肝蛋白的溶解度在等電點時（pH為4）時，溶解度最低，與其他pH組有顯著差異（P<0.05），這主要是由于雞肝蛋白在等電點時呈中性，缺乏分子間靜電排斥力，導致雞肝蛋白沉淀，從而降低了其蛋白溶解度。當pH值偏離等電點，溶解度增大，pH值大于7時的溶解度高于pH值小于7時的溶解度。

2.3.2 雞肝蛋白的持水性及吸油性蛋白質持水性是焙烤食品、肉制品等食品加工體系中的重要特性和功能指標。吸油性可增強食品對脂肪的吸附能力，從而改變其口感及風味。從表2可知，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白的持水性及吸油性分別提高了37.9%、29.5%（P

2.3.3 雞肝蛋白的起泡性及起泡穩(wěn)定性蛋白質起泡性在食品工業(yè)中具有重要作用，在飲料、咖啡等有著廣泛應用。由表2可知，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性分別提高了51.5%、75.9%（P<0.05），可能是由于超聲處理的機械效應和空化作用改變了雞肝蛋白結構，更多的疏水性基團和親水性基團暴露，具有更大的表面活性，從而降低水的表面張力，這與劉國琴等采用超聲提取的大豆分離蛋白的起泡性顯著增加是一致的，表明超聲提取具有提高雞肝蛋白起泡性及起泡穩(wěn)定性的作用。

2.3.4 雞肝蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性 蛋白質乳化性及乳化穩(wěn)定性在蛋糕、飲料等食品工業(yè)中具有重要作用。由表2可知，與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性分析提高了45.5%和37.0%（P<0.05）。這可能是由于通過超聲處理導致雞肝蛋白內部結構遭到破壞，其結構更加松散，使得疏水性基團具有親水親油性，使其乳化性能提高，這與羅娟采用超聲提取的豆粕蛋白，在一定的超聲功率下其乳化性及乳化穩(wěn)定性顯著提高一致，表明超聲處理提高了雞肝蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性。

3 結論

與常規(guī)水浴提取的雞肝蛋白相比，超聲輔助提取的雞肝蛋白的得率和總蛋白質含量均顯著提高（P<0.05），表明超聲輔助法可提高雞肝的利用率。

超聲輔助提取可導致雞肝蛋白的分子結構伸展，使其蛋白高級結構發(fā)生改變，但超聲作用并沒有改變雞肝蛋白的一級結構。同時，超聲輔助法可顯著提高雞肝蛋白的凝膠性能等作用，擴大了雞肝蛋白的潛在應用范圍。

與常規(guī)水浴提取相比，采用超聲提取可顯著提高雞肝蛋白的功能特性，該研究結果可為雞肝蛋白的精深加工及高值化利用提供理論基礎。