王偉琦　鄭亞冰　李昌　劉春燕　湯俊怡　常曉天

【摘要】 目的 探索雌激素刺激乳腺癌病變過程中染色體縮合調(diào)控子2（RCC2）的作用及機制。方法 收集乳腺標本，用蛋白免疫印跡法檢測RCC2蛋白表達水平；分別用雌激素（雌二醇）、RCC2 小干擾RNA（siRNA），雌激素聯(lián)合RCC2 siRNA處理MCF-7細胞，檢測細胞增殖與凋亡。結果 與乳腺纖維瘤組織相比，RCC2在雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌組織中的表達水平升高（P=0.001），在ER-乳腺癌組織中無升高（P=0.404）。抑制RCC2后ER+乳腺癌細胞系MCF-7增殖無變化（F處理=0.003，P=0.957），但凋亡比例比Allstars siRNA組高（t=2.679，P=0.037）；雌二醇處理MCF-7后增殖能力增強（F=110.323，P

【關鍵詞】 染色體縮合調(diào)控子2；雌激素；乳腺癌；細胞凋亡；細胞增殖

【Abstract】 Objective To explore the role of chromosomal condensation regulator 2 （RCC2） during the process of estrogen promoting the progression of breast cancer. Methods Human breast tissues were collected. Western blot was utilized to quantitatively detect the expression level of RCC2 protein. MCF-7 cells were treated with estrogen or RCC2 siRNA and combined use of estrogen and RCC2 siRNA. The cell apoptosis and cell proliferation were detected. Results Compared with the breast fibroma tissues， the expression level of RCC2 in the ER+breast cancer tissues was significantly up-regulated （P=0.001）， but there was no significant change in the ER-breast cancer tissues （P=0.404）. After inhibiting the expression of RCC2， the proliferation of MCF-7 cells did not significantly change （F=0.003， P=0.957）， whereas the apoptosis ratio of MCF-7 cells was significantly higher than that in the Allstars siRNA group （t=2.679， P=0.037）. After treated with E2， the proliferation of MCF-7 cells was evidently enhanced （F=110.323， P

【Key words】 Chromosomal condensation regulator 2； Estrogen； Breast cancer；

Cell apoptosis； Cell proliferation

乳腺癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤，雌激素受體陽性（ER+）的乳腺癌患者占總比約70%[1]。目前乳腺癌早期診斷方法主要為影像學檢查，尋找診斷及判斷乳腺癌預后的明星基因十分必要[2]。染色體縮合調(diào)控子2（RCC2）也被稱作TD60，位于染色體1p36位點[3]。其在胃癌組織中顯著上調(diào)，可篩選結直腸癌高危人群，同時也是黑色素瘤復發(fā)及生存率的決定因素[4-6]。最近有學者發(fā)現(xiàn)RCC2可通過誘導上皮細胞-間充質(zhì)轉化（EMT）促進肺腺癌的轉移[7]。盡管RCC2與眾多腫瘤的發(fā)生相關，但RCC2是否參與乳腺癌的致病至今尚未明確。在本研究中，筆者探究了RCC2是否在乳腺癌的致病過程中發(fā)揮作用，以及雌激素是否參與其中，從而為更有效治療乳腺癌、提高患者生存率提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、材 料

1.乳腺組織的獲取

收集2014年6月至2016年12月滕州市中心人民醫(yī)院保存的18例患者的乳腺組織，其中乳腺癌組織13例（ER+組織8例、ER-組織5例），乳腺纖維瘤組織5例。18例患者的年齡為41（20～70 ）歲。本研究計劃經(jīng)山東省千佛山醫(yī)院及滕州市中心人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

2.細胞株

乳腺癌細胞株MCF-7購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

3.主要試劑

MEM培養(yǎng)基購于美國Corning公司；無酚紅DMEM購于北京邁晨科技有限公司；葡聚糖-活性炭吸附血清購于以色列BI公司；胎牛血清購于浙江天杭生物科技股份有限公司；兔抗人RCC2單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；Cell Counting Kit-8細胞增殖試劑購于日本同仁公司；Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購于美國BioLegend公司；雌激素（雌二醇）純度>99%購于Sigma公司。

二、方 法

1.乳腺癌細胞培養(yǎng)

乳腺癌細胞株MCF-7用含10%胎牛血清+0.01 mg/ml牛胰島素的MEM培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)。做雌激素相關實驗之前，在含5%葡聚糖-活性炭吸附血清的無酚紅DMEM中培養(yǎng)MCF-7共3 d。

2.蛋白免疫印跡法檢測RCC2的蛋白表達

包括以下步驟：①組織蛋白提取，稱量乳腺組織50 mg，加入裂解液充分研磨，冰上裂解30 min，于4℃ 12 000轉/分離心30 min。取上清，于95℃變性15 min，于-80℃保存?zhèn)溆谩＂诩毎鞍滋崛?，轉染72 h后收集細胞，操作步驟同上。③蛋白免疫印跡法，取50 μg蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白恒流轉至PVDF膜上，RCC2單克隆抗體（1∶ 1 000）4℃過夜，二抗（1∶ 5 000）37℃孵育2 h。用ECL發(fā)光液在熒光成像儀檢測蛋白表達情況。

3.小干擾RNA（siRNA）轉染

將MCF-7鋪于6孔板，待細胞貼壁后進行轉染。實驗分為Allstars siRNA組和RCC2 siRNA組，轉染步驟根據(jù)HiPerFect Transfection Reagent說明書進行。

4.實時熒光定量PCR

轉染48 h后收集細胞，提取RNA。按TOYOBO逆轉錄試劑盒操作說明書將RNA逆轉錄為cDNA，采用實時熒光定量PCR檢測RCC2的mRNA表達水平。反應體系為SYBR Green 5 μl，ddH2O 2 μl，上下游引物各1 μl，cDNA 1 μl。反應條件為95℃預變性10 min，（95℃ 15 s，60℃ 34 s，72℃ 30 s）×45 cycle，72℃延伸3 min。

5.Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細胞增殖

轉染24 h后收集細胞鋪于96孔板。分別于轉染0、24、48、72 h向相應孔加入10 μl Cell Counting Kit-8溶液，培養(yǎng)箱孵育3 h。采用酶標儀測定吸光度（OD450），將數(shù)值進行相應統(tǒng)計。

6.Annexin V-FITC/PI流式分析檢測細胞凋亡

轉染48 h后取20×104～50×104個細胞離心，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞3遍，加入100 μl binding buffer 重懸，加入FITC 5 μl、PI 10 μl，混勻后室溫避光孵育15 min。每管加入400 μl binding buffer，重懸后上機檢測。

7.雌激素刺激實驗

包括以下步驟：①雌激素的配制，以無水乙醇為溶劑，將雌二醇配制成濃度為10-2 mol/L的儲存液。用無酚紅DMEM加5%葡聚糖-活性炭吸附處理過的胎牛血清為溶劑配制不同濃度的雌二醇（10-12、10-10、10-8、10-6、10-4 mol/L）以及含0.1%無水乙醇的對照組。②用Cell Counting Kit-8試劑盒檢測細胞增殖，方法同上。③用Annexin V-FITC/PI流式分析檢測細胞凋亡，方法同上。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料用±s表示。完全隨機設計的2組樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗；多組相互獨立的樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義者使用LSD-t檢驗進行兩兩比較；同一受試對象不同處理在不同時間點上變化情況的比較采用重復測量資料方差分析，差異有統(tǒng)計學意義者使用LSD-t檢驗進行兩兩比較；采用2×2析因設計的方差分析了解2種處理因素的效應及因素間交互作用。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、RCC2在乳腺癌組織中的表達

各組間RCC2蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義（F=10.851，P=0.001）。在此之后多重比較中，乳腺纖維瘤組織（0.242±0.054）與ER+乳腺癌組織（0.736±0.280）相比RCC2蛋白表達水平低（P=0.001）；而與ER-乳腺癌組織（0.352±0.115）相比RCC2蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P=0.404），見圖1。

二、RCC2 siRNA對RCC2 mRNA水平和蛋白表達的作用

與Allstars siRNA組相比，RCC2 siRNA組中RCC2的mRNA水平降低約75%，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.177，P=0.019），見圖2A； 與Allstars siRNA組RCC2的蛋白水平（0.951±0.150）相比，RCC2 siRNA組（0.504±0.313）較其降低約45%，分子量為56 kDa，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.251，P=0.017），見圖2B、C。提示本實驗所用si-RCC2能成功抑制MCF-7中RCC2 mRNA及蛋白水平的表達。

三、 RCC2 siRNA對MCF-7細胞增殖的影響

RCC2 siRNA組與Allstars siRNA組的細胞增殖比較差異無統(tǒng)計學意義（F處理=0.003，P=0.957），且處理與時間的交互作用的方差分析結果顯示兩者的交互作用無統(tǒng)計學意義（F時間*處理=0.03，P=0.992），見圖3。提示抑制RCC2的表達對MCF-7的細胞增殖無明顯影響。

四、RCC2 siRNA對MCF-7細胞凋亡的影響

轉染48 h后，RCC2 siRNA組細胞凋亡比例為（16.87±2.00）%，較Allstars siRNA組的（11.63±3.37）%高，比較差異有統(tǒng)計學意義（t=2.679，P=0.037），見圖4。提示抑制RCC2的表達可促進

五、雌二醇對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響

不同濃度雌二醇處理組的MCF-7細胞增殖隨時間的變化趨勢不同，處理與時間的交互作用的方差分析結果顯示其交互作用有統(tǒng)計學意義（F時間*處理=110.323，P<0.001，P-10<0.001，P-8<0.001，P-6<0.001，P- 六、雌二醇在MCF-7中對RCC2表達的影響

加入10-8 mol/L雌二醇處理MCF-7，分別在0、2、8、48 h收集細胞，檢測RCC2的表達。與0 h相比，RCC2的表達量隨時間的增加而增加，量化后的RCC2相對蛋白表達量作單因素方差分析在0 h（0.562±0.106）、2 h（0.818±0.676）、8 h（0.806±0.119）、48 h（1.235±0.304）之間差異有統(tǒng)計學意義（F=7.653，P=0.010）。與0 h相比，48 h的RCC2蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002），見圖6。提示雌二醇在MCF-7中可促進RCC2的表達。

七、雌二醇與RCC2 siRNA共同對MCF-7細胞增殖和凋亡的影響

MCF-7轉染24 h后，加入含0.1%乙醇的無酚紅DMEM或10-8mol/L雌二醇處理48 h，觀察2種因素對細胞增殖和凋亡的影響，見圖7。析因分析結果顯示，雌二醇與RCC2 siRNA 2種因素在MCF-7細胞增殖方面交互效應無統(tǒng)計學意義（F=0.281，P=0.604），在MCF-7細胞凋亡方面交互效應有統(tǒng)計學意義（F=18.897，P=0.002）。其中加入雌二醇可抑制細胞凋亡（F=108.599，P<0.001）。提示雌二醇促進細胞增殖不是通過調(diào)控RCC2實現(xiàn)的，而雌二醇抑制細胞凋亡可能通過調(diào)控RCC2實現(xiàn)。

討 論

乳腺癌是女性常見癌癥死亡原因之一，ER+乳腺癌是中老年乳腺癌的主要類型，雌激素在其致病過程中發(fā)揮重大作用[8]。RCC2是染色體乘客復合體（CPC）的一員，目前已知其在胃癌組織、黑色素瘤、肺腺癌、皮膚基底細胞癌患者及結直腸癌高危人群體內(nèi)顯著上調(diào)[4-7，9-10]。在本實驗中，筆者通過檢測不同類型乳腺組織RCC2蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)與乳腺纖維瘤組織相比，ER+乳腺癌組織RCC2表達量更高，而ER-乳腺癌組織與乳腺纖維瘤組織之間RCC2的表達量無明顯差異，提示RCC2可能通過提高表達水平參與ER+乳腺癌的發(fā)展。

為了探究RCC2在ER+乳腺癌中的生物學功能，筆者選擇ER+乳腺癌細胞系MCF-7進行一系列體外細胞功能學實驗。結果顯示，抑制RCC2在MCF-7中的表達可促進細胞凋亡，但對細胞增殖無明顯影響，說明抑制RCC2可影響乳腺癌細胞系MCF-7的凋亡。有研究顯示，RCC2參與細胞有絲分裂和紡錘體的組裝[9， 11]。此外，RCC2作為纖維蛋白依賴的黏附信號通路調(diào)控者參與調(diào)控Rac1和Arf6，從而影響細胞擴散與定向遷移[12-15]。關于RCC2是通過何種途徑調(diào)控細胞凋亡，Bruun等[5]認為抑制RCC2促進細胞凋亡這一現(xiàn)象可能與細胞有絲分裂有關，而RCC2作為CPC的一員與凋亡抑制基因Survivin等共同參與細胞有絲分裂和紡錘體的組裝，因此設想RCC2與Survivin共同參與有絲分裂，并通過影響細胞有絲分裂而調(diào)控細胞凋亡[9，11，16]。但具體通過何種通路調(diào)控尚需作進一步探索。

鑒于ER+乳腺癌細胞ER+的特征，用最佳濃度的雌激素（雌二醇=10-8mol/L）刺激MCF-7，細胞的增殖能力明顯增強，凋亡能力明顯減弱，提示雌激素能夠影響ER+乳腺癌細胞的增殖和凋亡。為了探究雌激素是否通過RCC2影響ER+乳腺癌細胞生物學功能，筆者用最佳濃度的雌激素作用于MCF-7，發(fā)現(xiàn)MCF-7中RCC2的表達量隨加入雌激素時間的增加而增加，說明雌激素可在MCF-7中調(diào)控RCC2，促進RCC2的表達。在抑制RCC2的基礎上加入雌激素刺激MCF-7，觀察2種因素共同作用于MCF-7時細胞增殖和凋亡的變化，結果提示雌二醇抑制細胞凋亡可能通過調(diào)控RCC2實現(xiàn)，而雌二醇促進細胞增殖并非通過調(diào)控RCC2實現(xiàn)。

綜上所述，本研究結果顯示了RCC2在ER+乳腺癌細胞中高表達，并影響ER+乳腺癌細胞凋亡，雌激素可能通過調(diào)控RCC2表達來抑制細胞凋亡從而促進ER+乳腺癌的癌變進程。

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（收稿日期：2017-11-30）

（本文編輯：洪悅民）