陳博雯 鄭圣晗 張莘 王統(tǒng)苗 王志秀 張揚 陳國宏 常國斌

摘要：雞BF1基因多態(tài)性與傳染性疾病的抗性有很大關(guān)系。雞BF1基因多態(tài)性及功能尚不清楚。本研究直接測定了25個雞種BF1基因序列，并與從NCBI下載的紅色原雞BF1基因進行了比較，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹進行分析。結(jié)果顯示，在這25個雞種中共檢測到了171個單核苷酸多態(tài)性（SNP），其中外顯子上發(fā)現(xiàn)了108個SNP。這些外顯子中SNP位點編碼氨基酸166個，其中有58個氨基酸發(fā)生變異，氨基酸序列同源性高于核苷酸。外顯子4和外顯子1的SNP數(shù)量最多，占46010以上，第5、第6、第7、第8外顯子屬于保守區(qū)域。核苷酸序列缺失主要發(fā)生在外顯子1和內(nèi)含子5上。25個雞種根據(jù)地理位置和氣候環(huán)境大致可被分為3大類。說明，BF1基因在核苷酸多態(tài)性水平上存在較高的變異性，為雞抗病育種提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞MHC; BF1基因;SNP; INDEL

中圖分類號：S858.31

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-4440（2018）05-1087-08

主要組織相容性復(fù)合體（MHC）在所有有頜脊椎動物的免疫系統(tǒng)中具有重要作用。在雞中，MHC-B區(qū)域編碼經(jīng)典的I類和II類分子，它是最具多態(tài)性的基因組區(qū)域，主要編碼參與先天和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此，該基因組區(qū)域?qū)τ跈C體抗病性和易感性至關(guān)重要。

在哺乳動物的免疫系統(tǒng)中，細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic T lymphocyte，CTL）對于病毒感染以及腫瘤等疾病的免疫與治療方面有其不可或缺的地位。當(dāng)一個抗原被識別后，將被分解成若干個多肽分子。MHC，類基因編碼的分子與細胞表面病原體衍生的多肽鏈結(jié)合，使細胞表面顯示出病原體，CTL通過其細胞表面的T細胞受體（T cell receptor，TCR）識別呈遞的抗原表位，從而對病原體細胞進行殺傷并誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。雞MHC主要有3個亞區(qū)，即BF（I類）、BL（II類）、BG（Ⅳ類）。雞幾乎所有的細胞均表達BF基因，BF抗原在MHC限制性抗原呈遞給細胞毒性T細胞過程中起核心作用。大多數(shù)雞MHC單倍型含有2個經(jīng)典的I類基因座，BF1和BF2。且有研究結(jié)果表明，BF1在靶細胞上表達的分子能夠強烈抑制雞NK細胞的殺傷?？梢?，BF1在雞體免疫應(yīng)答中發(fā)揮著極為重要的作用。

雞MHC位于第16號微小的染色體上，其中BF1基因位于DMB2和TA P1基因之間。有研究者指出，雞馬立克病的抗病性在很大程度上由基因決定，而雞MHC基因多態(tài)性與這種傳染性疾病的遺傳抗性高度相關(guān)，所以抗病育種在疾病控制方面發(fā)揮著越來越重要的作用。由于BF1基因在其他雞品種抗病性的研究甚少，尚不了解不同雞種BF1基因之間的差異。本研究利用目標區(qū)域捕獲測序技術(shù)對25個雞品種外周血淋巴細胞（Peripheralblood leukocytes，PBLs）中BF1基因序列進行測定，分析其SNP位點和Indel位點，找出不同雞種BF1基因序列上的差異，初步探討B(tài)F1基因在不同雞品種中的遺傳多態(tài)性及其進化機制，也為雞抗病育種工作的研究提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集25個不同雞品種的血樣，選取的25個雞種分別為，來自揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實驗室的雪山雞、青腳麻雞、廣西黃雞、文昌雞、溧陽雞、太湖雞、AA雞、羅斯雞、安卡雞、隱性白羽肉雞、如皋黃雞和東鄉(xiāng)綠殼蛋雞，來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽科學(xué)研究所國家地方禽種資源基因庫的泰和烏骨雞、大骨雞、仙居雞、北京油雞、白耳雞（BE）、鹿苑雞、斗雞、茶花雞、固始雞、藏雞、狼山雞和蕭山雞，來自云南省野生動物救護中心的紅色原雞亞種。

每個雞種選取10個樣本，并通過翅靜脈采集血液樣品l ml，保存在4 cC中。試驗采取苯酚和氯仿從血液中提取DNA。將同一品種10只雞的混合DNA樣品送到深圳華大基因公司進行目標序列捕獲測序，選擇Gallus_gallus-5.0作為參照基因組。高通量測序DNA樣本的范圍為雞16號染色體，位置為41803～139165，共計97363 bp。參考序列為紅色原雞的基因序列。GenBank登錄號為693260。

1.2 序列分析

從測序的DNA序列中選擇BF1基因，利用MEGA6.06軟件對25個雞種的基因序列進行比對分析，統(tǒng)計核苷酸突變位點，及與之相對應(yīng)的氨基酸突變位點和插入位點。構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并進行同源性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NCBI網(wǎng)站檢索Gallus gallus的BF1基因序列

BF1基因位于第16號染色體上的87140～89907位置。BF1基因總長2 768 bp，其中CDS區(qū)長為1083bp。在NCBI網(wǎng)站上檢索出Gallus gallus的BF1基因外顯子和內(nèi)含子情況如圖l所示。圖l顯示BF1基因由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。

2.2 不同雞種BF1基因的SNP位點和Indel位點分布

通過GenBank數(shù)據(jù)庫對8個外顯子和7個內(nèi)含子進行鑒定，確定其相對位置。每個外顯子和內(nèi)含子的SNP數(shù)目見表l。

與參考序列相比，25個雞種中BF1基因共有171個單核苷酸多態(tài)性。BF1基因外顯子中共有108個SNP，突變個數(shù)明顯多于內(nèi)含子，說明外顯子更具多態(tài)性。

由表l知，SNP主要發(fā)生在外顯子l和外顯子4上，其中外顯子4上有50個SNP，外顯子1次之，而外顯子5、外顯子6、外顯子7、外顯子8上沒有出現(xiàn)突變，說明這些外顯子區(qū)域比較保守。

表2中的“長度”表示不同雞種BF1基因的長度，由于BF1基因存在插入和缺失，雞種BF1基因長度不同。通過分析發(fā)現(xiàn)插入和缺失主要發(fā)生在外顯子1和內(nèi)含子5上。從表2中可以看出，與原雞序列相比，不同的25個雞種BF1基因序列都有核苷酸的缺失，其中AA雞、羅斯雞和安卡雞這些外來種發(fā)生核苷酸缺失最多，斗雞的核苷酸缺失最多達29個，狼山雞、綠殼蛋雞和茶花雞等地方種發(fā)生核苷酸缺失較少。大部分雞種BF1基因在外顯子l上都發(fā)生了較大片段的缺失，而大骨雞和固始雞BF1基因沒有核苷酸的缺失和插入以及單核苷酸突變（表3和表4），表明這2個雞種在BF1基因上具有保守性。

對于BF1基因.25個雞種中外顯子l上G/C突變發(fā)生較多，且都是非同義突變（V/L），其他都是同義突變。由表l知，外顯子l的核苷酸序列發(fā)生缺失，這些缺失也導(dǎo)致氨基酸缺失。在外顯子2和外顯子3上，這些雞種中分別有2個SNP位點為非同義突變，每個核苷酸突變導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸變異。外顯子4中C/T突變最多，且都是非同義突變。這些外顯子中SNP位點編碼的氨基酸有166個，其中有58個氨基酸發(fā)生了變異，表明氨基酸同源性高于核苷酸。

從表4中可以看出，不同雞種BF1基因外顯子4上有10個突變位點，核苷酸突變位點最多，其次是外顯子1，表明這2個外顯子區(qū)域具有豐富的多態(tài)性。

單核苷酸多態(tài)性存在于所有種中，25個雞種的外顯子中斗雞數(shù)量最多，氨基酸缺失數(shù)也最多。

2.3 BF1基因的MEGA系統(tǒng)進化樹分析

利用MEGA6.06對25個雞種的BF1基因進行對比分析，選用Construct/Test Neighbor-Joining Tree（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（圖2），Bootstrap的值設(shè)置成500。25個雞種根據(jù)其地理位置和氣候環(huán)境，大致可被分為3大類，文昌雞和雪山雞等聚為一類;斗雞、烏骨雞和鹿苑雞聚為一類;廣西黃雞單獨為一類。上述結(jié)果表明，BF1基因在進化過程中存在豐富的遺傳多樣性。

3 討論

本研究報告了雞BF1基因在25個雞種中的SNP以及Indel情況。如果只考慮外顯子中發(fā)生的SNP個數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)高變區(qū)外顯子4上的SNP數(shù)量最多，其突變比例在44%以上，相對應(yīng)氨基酸突變數(shù)目和突變位點也最多，由此可以推測外顯子4在BF1基因中起決定性作用，決定著BF1基因的遺傳多樣性，可能存在與疾病有關(guān)的變異，這一發(fā)現(xiàn)需要進一步驗證。而外顯子l上檢測到的單核苷酸多態(tài)性大部分是非同義替換，編碼的氨基酸沒有特定的差異，所以氨基酸水平上基本是保守的或半保守的?；谶@些特征，Shiina等報道，這種高度多態(tài)性似乎只能部分影響表達分子的結(jié)構(gòu)，而間接選擇可能是基因變異的主要驅(qū)動力。

本研究發(fā)現(xiàn)斗雞外顯子中的SNP數(shù)目最多，茶花雞、大骨雞和文昌雞等發(fā)生SNP數(shù)目較少，固始雞外顯子中沒有SNP，這與研究報道的中國斗雞的遺傳多樣性豐富，固始雞因其獨特的特征特性和相對封閉的形成歷史具有較好的保守性的研究結(jié)果相吻合。

在系統(tǒng)聚類中，25個雞種分為3大類，但不同種間置信度水平并不高，這是由于該基因變異度高導(dǎo)致不同雞種之間的同源性低，這可能與中國地方多種生態(tài)類型、種群演變歷史以及豐富的遺傳多樣性有關(guān)，例如觀賞性的河南斗雞、藥用的烏骨雞等;廣西黃雞單獨為一類，表明廣西黃雞BF1基因為單獨起源，又因其分布于廣西壯族自治區(qū)，屬于放牧飼養(yǎng)，整個雞群的生長都處在大自然狀態(tài)之下，生存能力和抗病性強：大骨雞，蕭山雞等其他21個雞種分為一類，其中羅斯雞與隱性白羽肉雞作為現(xiàn)代主要肉雞品種，具有生長速度快，飼料報酬高的特點，但同時也存在抗病力尤其是先天免疫性能相對較差的問題，BF1基因上SNP位點的缺失可能是影響因素之一。

雞的MHC多態(tài)性與疾病的抗性相關(guān)，如抗馬利克?。∕arek's disease，MD）。依照分子擬似學(xué)說，某些個體對疾病的易感是由于病原體的抗原結(jié)構(gòu)與MHC分子相似，致使免疫系統(tǒng)無法識別，不能有效攻擊病原體，由于多態(tài)性的存在使這種“擬似”受到限制，從而使病原體不能在群體中大面積傳播。本研究比對分析了25個雞種BF1基因的序列，充分顯示了雞BF1基因豐富的多態(tài)性，它為基因改造提供了豐富的資源，為更多疾病控制提供了候選基因。因此，研究雞BF1基因多態(tài)性對于研究雞抗病性和易感性具有不可或缺的作用。