高日麗　林可意　譚鶯　劉子瑜　許海霞

【摘要】 目的 探討建立2型糖尿病自然病程中高血糖自發(fā)緩解現(xiàn)象動物模型的可行性。方法 將8只C57BL/6J品系雄性小鼠（體質(zhì)量21 g）隨機分為高脂飲食組（4只）和對照飲食組（4只），分別予高脂飼料（20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、60%脂肪）和匹配對照飼料（70%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、10%脂肪）喂養(yǎng)。每周監(jiān)測2組體質(zhì)量、血糖、攝食量，為期12個月。高脂飲食誘導高血糖出現(xiàn)及自發(fā)緩解時行葡萄糖耐量實驗、胰島素耐量實驗。觀察終點檢測2組小鼠血清胰島素、血脂、腎臟功能及評價胰島β細胞質(zhì)量。結果 高脂飲食組空腹血糖呈現(xiàn)動態(tài)變化，第3個月開始出現(xiàn)空腹高血糖，與對照飲食組比較差異有統(tǒng)計學意義（P

【關鍵詞】 高脂飲食；2型糖尿??；胰島；血糖

【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of establishing an animal model of type 2 diabetes mellitus with spontaneous remission. Methods Eight male C57BL/6J mice （body weight=21 g） were randomly divided into high-fat diet（n=4）and control groups（n=4）. In the high-fat diet group， high-fat diet including 20% carbohydrate， 20% protein and 60% fat was delivered. In the control group， the diet consisting of 70% carbohydrate， 20% protein and 10% fat was fed. The body weight， blood glucose level and feed intake between two groups were monitored weekly for 12 months. The incidence of hyperglycemia was induced by high-fat diet. Upon spontaneous remission， glucose and insulin tolerance tests were performed. At the end of the experiment， serum levels of insulin and lipid， renal function and the quality of islet βcells were evaluated between two groups. Results In the high-fat diet group， dynamic changes were detected in the fasting blood glucose level. The fasting hyperglycemia began to occur in the 3rd month， significantly differed from that in the control group （P0.05） until the end of the observation. The phenotype of hyperglycemia with spontaneous remission was accompanied with persistent increase in body weight， progression of insulin resistance， enlargement of the average islet area and significant elevation of serum insulin level. Conclusion The C57BL/6J mouse models of type 2 diabetes mellitus with spontaneous remission can be established by fed with high-fat diet for 12 months.

【Key words】 High-fat diet； Type 2 diabetes mellitus； Islet； Blood glucose

2型糖尿?。═2DM）是一種代謝綜合征，其已成為嚴重危害公共健康的慢性疾病[1]。國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2015年全球20～79歲的人群中約有4.15億糖尿病患者，全球大約每6 s即有1例糖尿病患者死亡，中國90%的糖尿病患者為T2DM[2-3]。目前認為T2DM的主要發(fā)病機制是胰島素抵抗和（或）胰島素分泌功能障礙，診斷時殘存胰島β細胞約為40% ～60%，診斷后胰島β細胞功能呈進行性衰退[4]。另一方面，也有研究顯示疾病自發(fā)緩解的現(xiàn)象，診斷后未接受降糖藥物治療的122 781例T2DM患者，研究者對其隨訪7年，病程小于2年的患者疾病自發(fā)緩解率為4.6%，且疾病緩解與短病程、基線時GHbA1c僅輕度升高、未進行降糖藥物干預相關[5]。

為了進一步觀察T2DM的自然病程及相關機制，需要建立T2DM自發(fā)誘導緩解的動物模型。超體質(zhì)量、肥胖與T2DM的發(fā)生相關。在以高熱量膳食干預方法建立的肥胖小鼠模型上可觀察到胰島素抵抗、高胰島素血癥、輕度高血糖、高血脂等類似于早期T2DM臨床特征的表型，因而該模型被廣泛應用于T2DM的基礎研究[6]。既往研究者們常采用12～20周高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠至其隨機血糖穩(wěn)定達11.1 mmol/L為造模成功。此時，研究者可開始實施不同的干預措施觀察疾病進展或逆轉。我們對C57BL/6J小鼠采用單純高脂飲食喂養(yǎng)12個月，觀察其空腹血糖的動態(tài)變化，以期了解建立自發(fā)性緩解的T2DM動物模型的可行性。

材料與方法

一、實驗動物

8只6周齡健康C57BL/6J品系雄性小鼠（體質(zhì)量21 g）購自南京大學模式動物研究所。所有小鼠飼養(yǎng)于中山大學附屬第三醫(yī)院實驗中心SPF級動物房中，室溫（20±2）℃，相對濕度40% ～70%，每日12 h光照，晝夜循環(huán)，自由飲食飲水。

二、材料及儀器

飼料購于美國Research Diets公司，血糖檢測使用雅培Optium試紙，血清總膽固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C、尿素和肌酐采用酶法測定（全自動生化分析儀）。胰島素水平檢測采用超敏酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒（Mercodia），胰腺組織胰島素（Cell Signalling）染色使用免疫組織化學（免疫組化）檢測法。

三、實驗方法

1.實驗設計

8只小鼠適應性喂養(yǎng)2周后，根據(jù)體質(zhì)量按隨機數(shù)字表法將其分為高脂飲食組（4只）和對照飲食組（4只），分別予高脂飼料（20%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、60%脂肪）和匹配對照飼料（70%碳水化合物、20%蛋白質(zhì)、10%脂肪）喂養(yǎng)。每周記錄小鼠攝食量、稱量體質(zhì)量并于尾靜脈取血測空腹血糖（禁食6 h）。分別在高脂飲食誘導出空腹高血糖并持續(xù)3個月、空腹高血糖自發(fā)緩解并持續(xù)3個月時予所有小鼠行OGTT和胰島素耐量試驗（IPITT）。高血糖自發(fā)緩解指與對照飲食組相比空腹血糖值差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。繼續(xù)監(jiān)測小鼠的攝食量、體質(zhì)量和空腹血糖，總觀察期12個月。觀察終點處死小鼠，取全血分離血清于-80℃凍存，檢測空腹血糖、胰島素HOMA指數(shù)及總膽固醇等，取胰腺組織稱量質(zhì)量后用4%多聚甲醛固定、石蠟包埋常溫保存。

2.OGTT

小鼠禁食15 h，稱量體質(zhì)量并測定空腹血糖，取 20%葡萄糖溶液以2 g/kg的劑量灌胃后開始計時，分別檢測30、60、90、120 min小鼠尾靜脈微量血糖水平。

3.IPITT

小鼠禁食6 h后，稱量體質(zhì)量并測定空腹血糖，腹腔注射胰島素溶液（諾和銳，丹麥諾和諾德公司），劑量為0.8 U/kg，檢測注射后30、60、90 min小鼠尾靜脈微量血糖水平。

4.胰島素水平檢測

參照小鼠超敏胰島素定量檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫法）說明書，往包被微孔（板）中分別加入校準品、質(zhì)控品和樣本，將制備好的酶結合物1×溶液加入以上各孔進行孵育，與3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色反應后加入硫酸終止反應，最后通過酶標儀在450 nm處讀取反應的終點。繪制標準曲線算出樣本血清胰島素濃度。

5.胰腺組織胰島素與4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）免疫熒光染色

分離胰腺后迅速稱量質(zhì)量，用4%多聚甲醛固定胰腺，石蠟包埋后切片（5 μm）。用豚鼠抗胰島素一抗（1∶ 200稀釋，英國Abcam公司）4℃過夜孵育，然后用帶有Rhodamine熒光基團的驢抗豚鼠二抗（1∶ 200，美國Jackson Immuno Research公司）室溫孵育2 h，再用DAPI（美國Invitrogen公司）染核。使用Axio Imager Z1正置熒光顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）攝片。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，Graph Pad Prism軟件作圖。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)前后比較采用配對t檢驗，組內(nèi)前后多個時間點進行對比則先用單組重復測量資料方差分析，差異有統(tǒng)計學意義時再用配對t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示，組間比較采用秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、空腹血糖在高脂飲食誘導肥胖小鼠中的動態(tài)變化

基線時，2組小鼠空腹血糖水平無差異[高脂飲食組為（7.86±0.74）mmol/L，對照飲食組為（8.43±0.64）mmol/L，P=0.30]。飲食干預開始后，2組小鼠空腹血糖均呈逐漸上升趨勢，高脂飲食組上升更顯著。觀察第3個月，高脂飲食組血糖達（11.73±0.80）mmol/L，較對照飲食組（9.85±0.44）mmol/L高（P=0.006）。這一具有統(tǒng)計學差異的血糖分離趨勢持續(xù)至第7個月[高脂飲食組（11.34±1.45）mmol/L，對照飲食組（8.46±0.80）mmol/L，P=0.013]。第8個月高脂飲食組血糖水平下降至（10.03±1.73）mmol/L，而對照飲食組仍維持在8.50 mmol/L左右。此后，高脂飲食組血糖繼續(xù)逐漸下降，至第12個月為（8.26±1.47）mmol/L，對照飲食組為（7.54±0.14）mmol/L（P=0.91），見圖1A。

與空腹血糖的動態(tài)變化趨勢不同，觀察期內(nèi)小鼠體質(zhì)量呈持續(xù)增長趨勢，分為前5個月的快速增長期和后7個月的緩慢增長/平臺期?；€時，2組小鼠的體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學意義[高脂飲食組（24.99±0.76）g，對照飲食組（25.03±0.84）g，P=0.96]；前5個月中，高脂飲食組小鼠平均體質(zhì)量增長速度為每個月（5.78±0.64）g，對照飲食組小鼠為每個月（2.50±0.35）g（P<0.001）。期間，在第2個月末2組小鼠體質(zhì)量比較差異已具有統(tǒng)計學意義[高脂飲食組（36.84±3.44）g，對照飲食組（30.96±1.88）g，P=0.024]。隨著觀察時間延長，2組體質(zhì)量分離的趨勢加劇。至觀察終點，高脂飲食組體質(zhì)量為（59.90±2.79）g，較對照飲食組的（39.66±5.33）g高（P=0.004），見圖1B。

與體質(zhì)量持續(xù)增長趨勢不同，2組小鼠的月均攝入熱量在第1個月最高，此后逐漸下降，自第4個月始穩(wěn)定小幅波動直至觀察終點。組間比較結果顯示，1～8個月2組攝入熱量比較差異無統(tǒng)計學意義（P均>0.05），9～10個月，對照飲食組攝入熱卡略高于高脂飲食組，比較差異有統(tǒng)計學意義（P均<0.05），見圖1C。

A：12個月觀察期內(nèi)小鼠月均血糖；B： 12個月觀察期內(nèi)小鼠月均體質(zhì)量；C： 12個月觀察期內(nèi)小鼠月均攝食量；與對照飲食組比較，*為P<0.05，#為P<0.01

二、空腹高血糖自發(fā)緩解前后糖耐量、胰島素耐量的比較

觀察期第6個月（高脂飲食誘導出空腹高血糖并持續(xù)3個月）高脂飲食誘導的肥胖小鼠OGTT曲線下面積、IPITT曲線下面積均較對照飲食組大，且OGTT曲線下面積2組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2A、B。觀察期第11個月為高脂飲食組空腹高血糖自發(fā)緩解并持續(xù)3個月，此時OGTT結果示高脂飲食組空腹血糖較對照飲食組高，但兩者均在正常血糖范圍內(nèi)，分別為（6.07±0.56）mmol/L與（4.88±0.62）mmol/L（P=0.046），其他時間點2組小鼠血糖絕對值、曲線下總面積比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均>0.05），見圖2C。

IPITT結果顯示，對照飲食組小鼠血糖在注射胰島素后30 min血糖自基線時的（8.00±1.04）mmol/L降至（5.17±1.67）mmol/L，60 min時進一步降至谷值（4.33±1.72）mmol/L，之后略回升；而高脂飲食組小鼠血糖曲線平緩，無顯著降幅；2組在注射胰島素后各時間點血糖下降百分比絕對值及血糖下降百分比曲線下面積變化趨勢與觀察期第6個月時IPITT相似，見圖2D。

進一步比較前后2次OGTT在組內(nèi)的差異，結果提示對照飲食組各時間點血糖水平及OGTT曲線下面積前后比較無差異。高脂飲食組第11個月OGTT曲線下面積與第6個月比較差異無統(tǒng)計學意義，但經(jīng)單組重復測量資料方差分析，第11個月時糖負荷后各時間點血糖水平與第6個月時比較差異有統(tǒng)計學意義（F=21.95，P

三、空腹高血糖自發(fā)緩解伴隨胰島功能代償

空腹高血糖自發(fā)緩解現(xiàn)象維持至觀察終點。觀察終點處死小鼠時，2組各有1只小鼠因心臟穿刺采血失敗未能獲得足夠量血清，不納入血清指標統(tǒng)計分析。比較2組小鼠空腹血清胰島素水平，高脂飲食組較對照飲食組高（P=0.007），見表1。

胰腺組織切片胰島素染色顯示高脂飲食組胰島總數(shù)、長徑超過150 μm或面積大于3 000 μm2的大胰島比例較對照飲食組的多（分別為40.91%、43.18%；5.88%、5.88%），平均胰島面積較對照飲食組大（P=0.009，圖3A～D），提示胰島β細胞合成及分泌胰島素作用增強。

A：胰腺組織胰島素（Ins紅色）與DAPI（藍色）免疫熒光染色（×200）；B：單個胰島長短徑大小分布（×400，n=3）；C：單個胰島面積分布（×400，n=3）；D：平均胰島面積；與對照飲食組比較，#為P<0.01

進一步計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）和胰島素分泌指數(shù)（HOMA-β），HOMA-IR結果示高脂飲食組約為對照飲食組的4倍（表1），與觀察期第11個月IPITT結果一致，即高脂飲食顯著增加胰島素抵抗水平；而高脂飲食組的HOMA-β也較對照飲食組高，但比較差異無統(tǒng)計學意義，進一步行功效檢驗，效能為0.09，因此該指標陰性結果可能與本研究樣本量較小有關。高脂飲食組小鼠LDL-C較對照飲食組高（P<0.001）。2組血清肌酐、尿素氮比較差異均無統(tǒng)計學意義（P均>0.05），見表2。

討 論

在本研究中，筆者觀察到持續(xù)單純高脂飲食誘導空腹高血糖繼之自發(fā)緩解并伴隨糖耐量改善。這是據(jù)筆者所知首次觀察到的T2DM自發(fā)性緩解的動物模型。此模型具有以下特征，首先，糖代謝異常的自發(fā)緩解為完全代償，不僅表現(xiàn)為空腹高血糖回落，糖負荷后血糖水平亦恢復至對照小鼠水平。此模型中高血糖幅度較低，更為常用的T2DM動物模型是高脂聯(lián)合高糖飲食干預8～12周，或高脂聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素注射以達到更高的空腹血糖水平（15～20 mmol/L），這可能是既往未能在T2DM動物模型中觀察到空腹高血糖自發(fā)緩解現(xiàn)象的原因。其次，上述代償?shù)闹饕獧C制是胰島β細胞功能上調(diào)，表現(xiàn)為胰島數(shù)目及平均面積增加、血清胰島素水平顯著升高。在這一過程中，胰島素抵抗的程度無明顯改善，主要表現(xiàn)在高脂飲食誘導體質(zhì)量持續(xù)增加，即使在空腹高血糖完全自發(fā)緩解后，小鼠體質(zhì)量仍繼續(xù)緩慢上升；IPITT數(shù)據(jù)也提示較空腹高血糖出現(xiàn)時，空腹高血糖緩解時胰島素敏感性更低。需要指出的是，2次OGTT中，對照飲食小鼠糖負荷后60 min血糖水平亦略高于11.1 mmol/L，達到糖代謝異常的診斷標準。這一現(xiàn)象與C57BL/6J小鼠本身因為調(diào)控線粒體質(zhì)子泵的煙酰胺核苷酸轉氫酶（Nnt）突變導致胰島β細胞受葡萄糖刺激后胰島素釋放障礙有關。即C57BL/6J小鼠本身具有輕度糖耐量異常的遺傳特性[7]。最后，本模型中空腹高血糖程度較輕，單次最高空腹血糖未大于14 mmol/L，與在T2DM自發(fā)緩解的患者中觀察到的基線高血糖程度較輕的現(xiàn)象一致[5]。綜上所述，本模型特征是顯著肥胖并輕度高血糖，在至少8個月的高脂飲食干預中觀察到的胰島β細胞功能失代償繼之再被完全代償?shù)闹饕獧C制是高脂飲食誘導胰島β細胞功能上調(diào)。

由于單純高脂飲食誘導的肥胖模型被廣泛應用，迄今為止已有較多相關研究。目前認為高脂飲食能誘導胰島β細胞增殖、肥大及凋亡[8]。雄性C57BL/6J 小鼠中行短程高脂飲食干預可觀察到胰島β細胞質(zhì)量增加伴隨早期胰島β細胞Ki-67表達上調(diào)[9]。其他研究者使用高脂飲食干預4～7 d后即觀察到胰島β細胞Cyclin D2表達上調(diào)[10]。這些均提示高脂飲食對調(diào)節(jié)胰島β細胞增殖有促進作用。上述研究觀察時間相對較短，為高脂飲食的急性作用，小鼠空腹血糖未達11.1 mmol/L。有研究者在雌性小鼠中進行12個月的長程高脂飲食干預并誘導出肥胖表型，同樣觀察到胰島質(zhì)量的增加[11]。但迄今為止，上述肥胖表型與本研究中的空腹高血糖自發(fā)緩解表型存在差異，進一步在本模型上觀察胰島β細胞功能的動態(tài)變化及調(diào)控機制是探討T2DM自發(fā)緩解機制的直接途徑。

本研究的局限性包括：為單純的描述性研究，對小鼠空腹高血糖自發(fā)性緩解未行進一步機制探討，且2組小鼠數(shù)目均較少；另外，本模型中血糖僅出現(xiàn)輕度升高，所觀察到的自發(fā)緩解現(xiàn)象是否適用于血糖更高的模型如高糖高脂誘導的T2DM動物模型等，尚需進一步證實。在此模型上擴大樣本量，檢測胰島β細胞的增殖、肥大、凋亡、去分化等病理生理過程的變化，并結合體外實驗進行系統(tǒng)的胰島β細胞功能完全代償相關機制研究將是筆者進一步的研究方向。

參考文獻

[1] 湯磊樂，黃卓山，董睿敏，溫哲琦，陳璘. 代謝綜合征及其成分對冠脈動脈病變進展的作用. 新醫(yī)學，2017，48（5）：332-337.

[2] Ogurtsova K， da Rocha Fernandes JD， Huang Y， Linnenkamp U， Guariguata L， ChoNH， Cavan D， Shaw JE， Makaroff LE. IDF diabetes atlas： global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040. Diabetes Res Clin Pract，2017，128：40-50.

[3] 中華醫(yī)學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南（2013版）. 中國糖尿病雜志，2014，22（8）：2-42.

[4] Butler AE， Janson J， Bonner-Weir S， Ritzel R， Rizza RA， Butler PC. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes.Diabetes，2003，52（1）：102-110.

[5] Karter AJ， Nundy S， Parker MM， Moffet HH， Huang ES. Incidence of remission in adults with type 2 diabetes： the diabetes & aging study. Diabetes Care， 2014，37（12）：3188-3195.

[6] Surwit RS， Kuhn CM， Cochrane C， McCubbin JA， Feinglos MN. Diet-induced type Ⅱ diabetes in C57BL/6J mice. Diabetes，1988，37（9）：1163-1167.

[7] Toye AA， Lippiat JD， Proks P， Shimomura K， Bentley L， Hugill A， Mijat V，Goldsworthy M， Moir L， Haynes A， Quarterman J， Freeman HC， Ashcroft FM， Cox RD. A genetic and physiological study of impaired glucose homeostasis control in C57BL/6J mice. Diabetologia，2005，48（4）：675-686.

[8] Linnemann AK， Baan M， Davis DB. Pancreatic β-cell proliferation in obesity. Adv Nutr，2014，5（3）：278-288.

[9] Peyot ML， Pepin E， Lamontagne J， Latour MG， Zarrouki B， Lussier R，Pineda M， Jetton TL， Madiraju SRM， Joly E， Prentki M. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain： secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes，2010，59（9）： 2178-2187.

[10] Stamateris RE， Sharma RB， Hollern DA， Alonso LC. Adaptive b-cell proliferation increases early in high-fat feeding in mice， concurrent with metabolic changes， with induction of islet cyclin D2 expression. Am J Physiol Endocrinol Metab， 2013，305（1）：E149-E159.

[11] Ahrén J， Ahrén B， Wierup N. Increased b-cell volume in mice fed a high-fat diet： a dynamic study over 12 months. Islets，2010，2（6）：353-356.

（收稿日期：2018-01-30）

（本文編輯：洪悅民）