楊曉宇 徐雷 殷鑫歡 張繼宗 徐志文 朱玲

摘要：為了快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出豬非典型性瘟病毒（APPV）與豬流行性腹瀉病毒（PEDV），根據(jù)GenBank中發(fā)布的PEDV S2基因和APPV NS3基因的序列，分別選取PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列，設(shè)計(jì)、合成了1對(duì)特異性引物。通過(guò)對(duì)體系進(jìn)行優(yōu)化，分別擴(kuò)增出190 bp和500 bp的特異性片段。建立的雙重Rrr-PCR方法對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬輪狀病毒（RV）的檢測(cè)均為陰性。對(duì)PEDV和APPV的最低檢出量分別為1μl 2.65x103和1μl 3.56x104，對(duì)四川遂寧、眉山等地采集到的腹瀉、肌肉震顫的病料進(jìn)行檢測(cè)，PEDV、AP-PV陽(yáng)性病料檢出率分別為41.18%和11.76%，經(jīng)分別與特異性檢測(cè)APPV和PEDV的單一RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，符合率均為100%。與單一RT-PCR檢測(cè)方法具有相同特異性和重復(fù)性，可用于臨床檢測(cè)。

關(guān)鍵詞： 豬非典型性瘟病毒：豬流行性腹瀉病毒：雙重RT-PCR

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)： 1000-4440（2018）05-1081-06

豬非典型性瘟（APP）是豬非典型性瘟病毒（A—typical porcine pestivirus virus，APPV）引起的仔豬先天性震顫（俗稱(chēng)“抖抖病”），APP在臨床上可以導(dǎo)致出生仔豬全身肌肉震顫、八字腿、嚴(yán)重可導(dǎo)致全身震顫，吮乳困難。規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)豬發(fā)病率在5%左右。先天性震顫（Congenital tremor）可以分為A、B兩種類(lèi)型，B型沒(méi)有明顯的組織損傷，A型有明顯的大腦脊柱的組織損傷。根據(jù)腦和脊柱的受傷程度可將A型分為I—V5種亞型，其中A-III型先天性震顫是只有在長(zhǎng)白豬品種中存在的遺傳性疾病，其特征是髓鞘缺失，少突細(xì)胞減少;A-IV型，其特點(diǎn)是腦脊髓髓鞘形成過(guò)少引起的;A-V型病例是由敵百蟲(chóng)中毒引起，常導(dǎo)致小腦發(fā)育不全;只有A-I與A-II是傳染病，A-I型是由豬瘟病毒（CSFV）引起的，但是A—II型的病因此前尚未可知。Hause等驗(yàn)證了APPV是引起仔豬先天性震顫的主要病原，通過(guò)分子和血清學(xué)檢測(cè)，證明了APPV在美國(guó)豬群的廣泛存在，隨后，德國(guó)、荷蘭、奧地利等多個(gè)國(guó)家先后發(fā)現(xiàn)豬群存在APPV流行。豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV）是引起豬流行性腹瀉（Porcineepidemic diarrhea，PED）的主要病原，PED是臨床上引起水樣腹瀉、嚴(yán)重腸炎、嘔吐、脫水和食欲下降為癥狀的高度接觸性腸道傳染病。由于其傳染性強(qiáng)和較短的病程，哺乳仔豬的死亡率可達(dá)50%～ 90%，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失。1977年，在比利時(shí)養(yǎng)豬場(chǎng)分離出一種與腹瀉相關(guān)的新型冠狀病毒樣顆粒，隨后在中國(guó)、加拿大、德國(guó)、日本、韓國(guó)等國(guó)家相繼報(bào)道了該病毒。2009年以來(lái)，韓國(guó)、日本相繼有PED發(fā)生，2010年冬季以來(lái)，中國(guó)也大規(guī)模爆發(fā)PED。

APPV和PEDV都是RNA病毒，均可導(dǎo)致出生仔豬發(fā)病。母源抗體是保護(hù)仔豬預(yù)防PEDV的重要手段之一。APPV的感染導(dǎo)致仔豬吮乳困難，嚴(yán)重影響仔豬對(duì)母乳的攝入，從而導(dǎo)致母源抗體對(duì)出生仔豬的保護(hù)力不足。為了進(jìn)一步研究APPV和PEDV兩者之間的感染狀況與疾病的損傷，本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)APPV和PEDV的雙重RT-PCR方法，為疾病診斷提供一個(gè)快速、靈敏、高效的檢測(cè)方法，為疾病防控提供合理依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和病料

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductiveand respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬非典型性瘟病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬輪狀病毒（Rotavirus，RV）、大腸桿菌（Escherichia coli）均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生物技術(shù)中心保存;病料（腸道、腸系膜淋巴結(jié)、腦、腹股溝淋巴結(jié)）采自四川眉山、遂寧、宜賓、瀘州、自貢等各市規(guī)?；B(yǎng)豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、RNAiso plus、Taq Hs、10×Reaction Buffer（Mg2+ free）、dNTP Mix、ddH2 0、pMD19-T載體均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，DNA凝膠回收試劑盒（DNA Gel Extraction Kit）和質(zhì)粒提取試劑盒（Plasmid Kit I）購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)表的PEDV S2基因（登錄號(hào)：JQ638513.1）和APPV NS3基因（登錄號(hào)：MF069133.1）相關(guān)序列，選取其保守序列，并通過(guò)NCBI進(jìn)行特異性比對(duì)，分別設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物（表1），由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 樣品處理及核酸的提取

將獲得的PEDV和APPV樣品分別編號(hào)，將編號(hào)的樣品在研磨器中多點(diǎn)取樣，剪碎后加入適量的液氮，研磨成粉末狀后加生理鹽水形成研磨液，-20℃反復(fù)凍融3次后備用。采用Trizol法提取病料的總RNA，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。轉(zhuǎn)錄體系（10μl）為：總RNA 3.0μl，5xPrimescript buffer2.0μl，Primer script RT en-zyme Mix1 0.5μl，Oligo dT Primer 0.5μl，Random 6mers 0.5μl，RNase free dH20 3.5μl。反轉(zhuǎn)錄的條件是：37℃15min，85℃30s，將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用所設(shè)計(jì)的引物對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為（25μl）：總RNA2.0μl，1OxReaction buffer 2.5μl，dNTP Mixl.0μl，Taq Hs 0.5μl，dd H20 18.0μl，上下游引物各0.5μl。反應(yīng)條件為：95℃4 min;95℃30 s，58℃30s，72℃30s，30個(gè)循環(huán)：72℃7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 目的片段的克隆及測(cè)序

將擴(kuò)增出來(lái)的單一條帶用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。將陽(yáng)性克隆送到生工生物工程（上海）有限公司測(cè)序，并將陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)后用質(zhì)粒提取試劑盒提取PEDV、APPV質(zhì)粒，作為后續(xù)試驗(yàn)的陽(yáng)性模板。

1.6 雙重RT-PCR的建立

1.6.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的優(yōu)化 在單一PCR的基礎(chǔ)上，分別改變單一變量對(duì)PEDV和APPV的混合模板進(jìn)行檢測(cè)。體系為25μl，分別調(diào)整Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix的用量，選取Mg2+的用量依次為0.5μ1、l.0μl、1.5μ1、2.0μl、2.5μl和3.0μl，選取Taq Hs的用量依次為0.1μl、0.2μ1、0.3μ1、0.4μl、0.5μl和0.6μl，選取dNTP Mix的用量依次為1.0μl、1.5μl、2.0μl、2.5μl、3.0μl和3.5μl。進(jìn)行雙重RT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序同方法1.4單一PCR擴(kuò)增。在保證單一變量的情況下，選取目的條帶效果最好的試劑用量。

1.6.2 引物及退火溫度的優(yōu)化 在優(yōu)化Mg2+、TaqHs、dNTP Mix用量的基礎(chǔ)上，單一改變引物用量和退火溫度，其引物用量選取1.0μl、1.5μl、2.0μl和2.5μ1，退火溫度選取50.8℃、51.8℃、53.1℃、58.6℃、59.9℃、61.0℃和61.6℃。用來(lái)篩選最適引物用量和退火溫度。

1.6.3 特異性試驗(yàn)在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上，用建立的雙重RT-PCR方法對(duì)PRRSV、CSFV、RV、PEDV、APPV進(jìn)行特異性檢測(cè)，設(shè)立陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6.4 重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)APPV和PEDV陽(yáng)性病料進(jìn)行抽提，以反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板，用建好的雙重RT-PCR方法分別進(jìn)行批間、批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，已驗(yàn)證所建立方法的穩(wěn)定性。

1.6.5 敏感性試驗(yàn) 用質(zhì)粒提取試劑盒提取PEDV、APPV質(zhì)粒，用核酸蛋白儀測(cè)定所構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒的質(zhì)量濃度，計(jì)算出模板的拷貝數(shù)。在上述優(yōu)化體系優(yōu)化后，將模板倍比稀釋進(jìn)行雙重RT-PCR。

1.6.6 符合性檢測(cè) 用本研究建立的雙重RT-PCR方法對(duì)四川遂寧、眉山等地采集的病料進(jìn)行雙重RT-PCR和單- PCR的檢測(cè)，并對(duì)結(jié)果、檢出率和符合率進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1 Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix用量的優(yōu)化

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，當(dāng)Mg2+、Taq Hs、dNTP Mix依次為2.5μ1、0.6μl、1.0μl時(shí)，擴(kuò)增出來(lái)的2條條帶最為清晰（圖l、圖2、圖3）。

2.2 引物及退火溫度的優(yōu)化

優(yōu)化結(jié)果顯示為，當(dāng)引物用量為lμl（圖4），退火溫度為58.6℃時(shí)（圖5），該方法同時(shí)擴(kuò)增出來(lái)的APPV和PEDV特異性條帶亮度相對(duì)最清晰。

2.3 特異性試驗(yàn)

用所建立的雙重RT-PCR對(duì)PRRSV、CSFV、RV、APPV、PEDV進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖6）顯示，PRRSV、CSFV、RV均為陰性，該方法能特異性檢測(cè)出APPV和PEDV，證明該方法具有很強(qiáng)的特異性。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

用所建立的雙重RT-PCR對(duì)陽(yáng)性模板進(jìn)行批間與批內(nèi)重復(fù)性檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示陽(yáng)性模板所擴(kuò)增出來(lái)的目的條帶完全相同，證明該方法有良好的重復(fù)性。

2.5 敏感性試驗(yàn)

采用建立的雙重RT-PCR的方法和優(yōu)化的體系對(duì)倍比稀釋后的模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果（圖8）顯示PEDV的最低檢出量為lμl 2.65×l05，APPV的最低檢出量為lμl 3.56x104，證明該方法敏感性較強(qiáng)。

2.6 符合性檢測(cè)

對(duì)34份采自四川遂寧、眉山等地的疑似病料進(jìn)行雙重RT-PCR和單一PCR的檢測(cè)，結(jié)果（表2）顯示檢出PEDV陽(yáng)性病料14份，單一感染陽(yáng)性率41.18%。檢出APPV陽(yáng)性病料4份，單一感染陽(yáng)性率11.76%。檢出二者混合感染l份，檢出率2.94%。雙重RT-PCR與單一PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較分析，符合率均為100%（表3）。

3 討論

最近幾年，PEDV的感染率越來(lái)越高，由于其傳染性強(qiáng)和較短的病程，哺乳仔豬的死亡率可達(dá)50%～90%.給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的損失。新生仔豬的免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全，對(duì)其進(jìn)行PEDV疫苗注射無(wú)法誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的體液免疫和腸道黏膜的免疫，所以母源抗體對(duì)新生仔豬尤為重要。初乳中免疫球蛋白主要為IgG，乳汁中主要為SIgA，乳汁的黏膜免疫對(duì)新生仔豬保護(hù)力已經(jīng)被試驗(yàn)證明。新生仔豬需要足夠的免疫乳汁來(lái)抵抗PEDV感染，所以新生仔豬能夠喝到初乳和乳汁尤為重要。先天性震顫是新生仔豬常見(jiàn)的一種現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致新生仔豬全身肌肉震顫，盡管搖動(dòng)本身并不直接導(dǎo)致死亡，但震顫可以妨礙仔豬發(fā)現(xiàn)奶嘴，從而導(dǎo)致仔豬喝不到足夠的初乳和乳汁，嚴(yán)重的可導(dǎo)致發(fā)育遲緩或死亡。自2010年，新一輪PEDV在全球流行，作者認(rèn)為，造成PEDV新一輪流行的原因除了PEDV變異株的出現(xiàn)，規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)疫苗免疫程序不當(dāng)，現(xiàn)行疫苗無(wú)法對(duì)其進(jìn)行有效的保護(hù)之外，出生仔豬是否能夠得到母源抗體的保護(hù)也是一個(gè)很重要的方面。而非典型性瘟病毒恰恰會(huì)導(dǎo)致出生仔豬全身震顫，妨礙仔豬發(fā)現(xiàn)奶嘴。有報(bào)道，中國(guó)新生仔豬先天性震顫在規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)病率約為5%～6% ，在大多數(shù)受到新生仔豬先天性震顫影響的豬場(chǎng)中，APPV的發(fā)現(xiàn)率在1%～20%。本次試驗(yàn)建立的雙重RT-PCR方法，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和試劑用量，可以同時(shí)檢測(cè)出PEDV、APPV。相較于單一RT-PCR方法更為簡(jiǎn)單、省時(shí)、省力，同時(shí)也節(jié)約了檢測(cè)試劑的損耗。根據(jù)PEDV S2基因和APPV NS3基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，保證了擴(kuò)增出來(lái)的目的片段高度保守，防止了因?yàn)椴《镜淖儺惗鴮?dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的假陰性。研究中所設(shè)計(jì)的2對(duì)引物分別能夠擴(kuò)增出190 bp和500 bp的目的條帶，與設(shè)計(jì)的引物長(zhǎng)度一致，證明了該方法的特異性。對(duì)PEDV和APPV的最低檢出量分別為lμl 2.65xl05和1μl 3.56x104，具有較高的靈敏性。對(duì)樣品進(jìn)行符合性檢測(cè)，符合率為100%，證明該方法的可行性。相較于單一RT-PCR方法，省時(shí)、省力、特異、敏感，對(duì)PEDV和APPV混合感染的檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。