朱培霞 易成文 周翠

摘要目的：探討蒼術(shù)黃柏藥的配伍規(guī)律對(duì)藥效物質(zhì)的影響，闡釋中藥合理配伍的科學(xué)內(nèi)涵。方法：采用高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜分析進(jìn)行線性關(guān)系分析以及加樣回收率試驗(yàn)考察HPLC的嚴(yán)謹(jǐn)性。HPLC指紋圖譜：取小檗堿和黃柏堿對(duì)照品溶液和蒼術(shù)黃柏1∶1、1∶2、1∶3、0∶1、2∶1、3∶1、1∶0等不同配伍供試品溶液進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析。結(jié)果：以蒼術(shù)黃柏供試品溶液獲取的HPLC色譜圖中小檗堿和黃柏堿的保留時(shí)間與對(duì)照品外標(biāo)法一致。1024～1024 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為9980%，RSD為20%，顯示加樣回收率試驗(yàn)良好，HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性高。蒼術(shù)黃柏不同配伍規(guī)律中非共有峰面積以3∶1配伍比例為最高為1062%，其次是1∶1配伍比例為806%。結(jié)論：蒼術(shù)黃柏配伍不同配伍規(guī)律中3∶1配伍比例對(duì)小檗堿的影響最小，臨床組方中發(fā)揮的黃柏作用藥效就較好；從而說(shuō)明中藥配伍和藥物劑量對(duì)于充分發(fā)揮藥物療效至關(guān)重要。

關(guān)鍵詞高效液相色譜法，蒼術(shù)，黃柏，配伍規(guī)律，藥效物質(zhì)

Study on Effects of Compatibility Regularity of Rhizoma Atractylodis and Cortex Phellodendri on Pharmacodynamic Substance

Zhu Peixia1， Yi Chengwen2， Zhou Cui1

（1 Department of Pharmacy， Xinyang Hospital of Traditional Chinese Medicine， Henan 464000， China； 2 Department of Pharmacy， Xinyang Central Hospital， Henan 464000， China）

AbstractObjective：To explain the scientific connotation of the rational compatibility of Chinese herbal medicine based on the HPLC analysis， and discuss the effects of compatibility regularity of Rhizoma Atractylodis and Cortex Phellodendri herbs on pharmacodynamic substance. Methods：The linear relationship was analyzed by HPLC and the sample recovery test was used to investigate the preciseness of HPLC. HPLC fingerprint： berberine and phellpdendrine comparison liquor， and Atractylodes rhizome and Cortex Phellodendri were used to make the test solution by the proportion of 1∶1， 1∶2， 1∶3， 0∶1， 2∶1， 3∶1， 1∶0， which were analyzed by HPLC fingerprint. Results：1） The retention time of berberine and phellpdendrine in Atractylodes rhizome and Cortex Phellodendri test solution was consistent with external standard method of control products by HPLC chromatogram. 2） The linear relationship was good in the range of 1024 to 1024 μg. 3） The average recovery rate of sample recovery teste was 9980%， and RSD was 2%， which showed that the sample recovery rate was good， and HPLC had a high conscientiousness. 4） In the different compatibility rules of Rhizoma Atractylodis and Cortex Phellodendri， the non common peak area was the highest with the ratio of 3∶1 compatibility to 1062%， followed by 1∶1， the proportion of compatibility was 806%. Conclusion：The effect of 3∶1 compatibility proportion of Atractylodes rhizome and Cortex Phellodendri has the minimum effect on berberine， and Cortex Phellodendri has a good pharmaceutical effect， indicating the compatibility and drug dose play an important role in giving full play to the effects of the drugs.

Key WordsHPLC； Rhizoma Atractylodis； Cortex Phellodendri； Compatible regularity； Pharmacodynamic substance

中圖分類號(hào)：R282文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.07.051

復(fù)方配伍是根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論的一種中醫(yī)藥用藥特色，而藥對(duì)配伍是臨床上常用的相對(duì)固定的2味藥或3味藥的配伍形式。藥對(duì)配伍組成多具有一定規(guī)律，研究藥對(duì)配伍有助于揭示中醫(yī)學(xué)流傳下來(lái)的方劑配伍的科學(xué)內(nèi)涵，幫助臨床醫(yī)師和藥師從具有引導(dǎo)價(jià)值和點(diǎn)面結(jié)合的科學(xué)意義[13]。蒼術(shù)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物蒼術(shù)的干燥根莖，具有燥濕、化濁、止痛等功效，其主要有效成分為揮發(fā)油、蒼術(shù)醇化合物。黃柏為菊科植物黃柏的干燥樹皮，具有清熱、解毒、燥濕功效，黃柏又名黃檗，其藥用部分為是蕓香科黃檗屬落葉喬木的樹皮內(nèi)層入藥，其中主要含小檗堿和黃柏堿化合物等。臨床常用蒼術(shù)黃柏配伍，經(jīng)典的方劑有二妙散，為治療濕熱下注之基礎(chǔ)方，方中以蒼術(shù)黃柏配伍共奏清熱燥濕，標(biāo)本兼顧之效[4]。本實(shí)驗(yàn)以蒼術(shù)黃柏配伍不同比例配伍，采用高效液相色譜法（HPLC）以黃柏堿和小檗堿作為對(duì)照品，探討蒼術(shù)黃柏配伍變化規(guī)律對(duì)藥效物質(zhì)的影響，為該方在臨床上的合理應(yīng)用及進(jìn)一步開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料

Agilent 1100型高效液相色譜儀；250 mm×46 mm，5 μm的色譜柱（Waters C18柱）；購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713200911）；購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)：must11062401）。

2方法

21色譜條件精密量取10 μL的樣品進(jìn)樣量或?qū)φ掌啡芤?，采?50 mm×46 mm，5 μm的色譜柱（Waters C18柱），在乙腈和01%磷酸的流動(dòng)相中，流速為1 mL/min，柱溫為30 ℃，根據(jù)高效液相色譜法（HPLC）（Agilent 1100型高效液相色譜儀）指紋圖譜的梯度洗脫程序進(jìn)行試驗(yàn)。見表1。

22供試品溶液制備蒼術(shù)為菊科蒼術(shù)屬多年生草本植物的干燥根莖，黃柏為菊科植物黃柏的干燥樹皮，蒼術(shù)黃柏采用1∶1、1∶2、1∶3、0∶1、2∶1、3∶1、1∶0等不同配伍規(guī)律，采用回流法煎煮，于敞口藥盆中稱取黃柏始終未3 g，根據(jù)不同配伍規(guī)律，配伍蒼術(shù)黃柏加200 mL水，浸泡30 min，煮沸后文火45 min，取100 mL藥液，在60 ℃下減壓濃縮，定容至50 mL，折合柴胡黃芩藥物水煎液濃度未02 g/ mL。取5 mL柴胡黃芩濃縮液用100%甲醇定容10 mL，混合均勻，取2 mL離心取上清液在045 μm超微膜濾過(guò)即可制備蒼術(shù)黃柏配伍供試品溶液。

23對(duì)照品溶液制備精密稱取購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)：110713200911）、購(gòu)于北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司黃柏堿對(duì)照品（批號(hào)：must11062401）置于容量瓶中，甲醇溶解，制成0422 mg/mL小檗堿對(duì)照品溶液和0411 mg/mL黃柏堿對(duì)照品溶液。

24高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜分析

241HPLC方法學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性考察1）線性范圍試驗(yàn)[5]：根據(jù)11制備的小檗堿對(duì)照品溶液，精密取0 μL、2 μL、6 μL、8 μL、16 μL、20 μL，分別編號(hào)1～6并連續(xù)進(jìn)樣，以峰面積為Y軸，5 μL進(jìn)樣濃度為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)對(duì)照品的回歸方程計(jì)算各有效成分在各自濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系。2）加樣回收率試驗(yàn)：取6份同一配伍比例1∶1蒼術(shù)黃柏供試品溶液，根據(jù)11制備的供試品溶液，編號(hào)AF并分別加入2 mL對(duì)照品溶液，計(jì)算供試品在HPLC中的加樣回收率。

244指紋圖譜取蒼術(shù)黃柏配伍供試品溶液、對(duì)照品溶液和缺蒼術(shù)的陰性對(duì)照溶液，分別精密吸取5 μL根據(jù)色譜條件依次測(cè)定并記錄色譜圖。

25數(shù)據(jù)處理根據(jù)國(guó)家藥典委員會(huì)提出的中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A進(jìn)行相似度分析，采用MATLAB軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)。

3結(jié)果

31對(duì)照品溶液HPLC色譜圖采用對(duì)照品溶液獲得HPLC色譜圖得小檗堿和黃柏堿的保留時(shí)間分別為396 min和191 min，并且與其他組分分離良好。見圖1。以蒼術(shù)黃柏供試品溶液獲取的HPLC色譜圖中小檗堿和黃柏堿的保留時(shí)間與對(duì)照品外標(biāo)法一致。見圖2。

32線性關(guān)系考察結(jié)果在線性關(guān)系考察中以蒼術(shù)甲苷進(jìn)樣量的自然對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（lgX），峰面積的自然對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（lnY）進(jìn)行回歸，得回歸方程lnY=1508 2lgX+13918（r=0999 7），因此在1024～1024 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

33加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果中平均回收率為9980%，RSD為20%，顯示加樣回收率試驗(yàn)良好，HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性高。見表2。

34蒼術(shù)黃柏不同規(guī)律配伍前后指紋圖譜蒼術(shù)黃柏采用1∶1、1∶2、1∶3、0∶1、2∶1、3∶1、1∶0等不同配伍規(guī)律，以1∶1蒼術(shù)黃柏配伍樣品供試品溶液為參照?qǐng)D譜，生成圖3共有峰模式。

35蒼術(shù)黃柏不同規(guī)律配伍非共有峰面積蒼術(shù)黃柏不同配伍規(guī)律中非共有峰面積以3∶1配伍比例為最高為1062%，其次是1∶1配伍比例為806%。

4討論

41流動(dòng)相的選擇本研究前期工作中通過(guò)對(duì)乙腈甲醇、四氫呋喃水、乙腈磷酸的HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性進(jìn)行考察，篩選出了乙腈磷酸系統(tǒng)流動(dòng)相的分離效果較好，但在以乙腈磷酸不同的比例條件下等度洗脫的摸索中，發(fā)現(xiàn)乙腈磷酸水的條件下小檗堿和黃柏堿的分離度相對(duì)較好，根據(jù)查閱大量文獻(xiàn)[68]發(fā)現(xiàn)采用梯度洗脫后，發(fā)現(xiàn)以乙腈水梯度洗脫，在55 min內(nèi)將小檗堿和黃柏堿完全分離，基線噪聲較低；為了進(jìn)一步降低基線噪聲，獲得最好的共有峰形，本團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)磷酸水的濃度進(jìn)行了考察，分別用01%、02%、03%的磷酸水溶液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)乙腈01%磷酸水溶液為流動(dòng)相的分離效果最好，能夠分離出最低基線噪聲且峰形最好[912]。

42HPLC嚴(yán)謹(jǐn)性考察意義線性考查在某一個(gè)濃度或峰高（面積）情況下進(jìn)行樣品分析是否是準(zhǔn)確的，而準(zhǔn)確的概念就是要成線性，換句話說(shuō)，在這個(gè)范圍內(nèi)，待測(cè)樣品面積要與濃度成正比，即符合紫外檢測(cè)器的朗伯比爾定律因?yàn)橹挥羞@樣，在這個(gè)范圍內(nèi)濃度與面積成正比，分析結(jié)果才是準(zhǔn)確的[1315]。而加樣回收率包括絕對(duì)回收率和相對(duì)回收率，本研究涉及的是相對(duì)回收率。相對(duì)回收率嚴(yán)格來(lái)說(shuō)有2種，一種是回收試驗(yàn)法，一種是加樣回收試驗(yàn)法[16]。而本研究的目的主要是為了考察HPLC的嚴(yán)謹(jǐn)性，因此選用加樣回收試驗(yàn)法，也就是是在已知濃度樣品中加入藥物，來(lái)和標(biāo)準(zhǔn)曲線比，標(biāo)準(zhǔn)曲線也是在基質(zhì)中加藥物。

43蒼術(shù)黃柏配伍規(guī)律對(duì)藥效物質(zhì)的影響本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，配伍前后指紋圖譜在保留時(shí)間方面變化不大，RSD均小于3%；在此測(cè)定條件下，峰的個(gè)數(shù)無(wú)明顯差異，說(shuō)明黃柏配伍蒼術(shù)之后可能沒有新成分產(chǎn)生；相似性評(píng)價(jià)在黃柏、蒼術(shù)不同配伍比例水煎液HPLC指紋圖譜的重疊圖中，以小檗堿為參照峰，可以確定10個(gè)共有峰。由蒼術(shù)和黃柏二藥配伍后品共有峰面積的變化可以看出，配伍之后化學(xué)成分的含量存在變化，其平均RSD值為1787%。并且可以看出其生物堿的含量隨蒼術(shù)質(zhì)量的增加而減少，黃柏、蒼術(shù)3∶1的配伍比例中，小檗堿的含量最大。其他峰形也隨配伍劑量的改變也有所變化，提示該配伍比例對(duì)小檗堿的影響最小，臨床組方中發(fā)揮的黃柏作用藥效就較好；從而說(shuō)明中藥配伍和藥物劑量對(duì)于充分發(fā)揮藥物療效至關(guān)重要。

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（2017-06-07收稿責(zé)任編輯：楊覺雄）