李琳霈　楊曉　潘博　譚小寧　羅吉　蔣益蘭

〔摘要〕 目的 研究中藥疏肝健脾解毒方對人乳腺癌細胞MCF-7增殖及凋亡的影響。方法 采用CCK8法檢測藥物干預12 h、24 h、48 h后對MCF-7細胞增殖的影響（分為空白對照組、陽性藥物對照組及不同濃度中藥組）；采用流式細胞術(shù)檢測藥物干預36 h及48 h后對細胞晚期凋亡率的影響（分為空白對照組、中藥組及陽性藥物對照組）。結(jié)果 中藥組吸光度低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且隨藥物濃度增高，吸光度逐漸降低；12 h至24 h，隨著作用時間延長，吸光度亦逐漸降低；24 h后較高濃度中藥組吸光度與陽性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。與空白組比較，中藥組細胞晚期凋亡率較高，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），但中藥組細胞凋亡率低于陽性對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01）。結(jié)論 疏肝健脾解毒方對人乳腺癌細胞MCF-7增殖有一定的抑制作用，可能通過誘導細胞凋亡實現(xiàn)。

〔關鍵詞〕 疏肝健脾解毒方；人乳腺癌細胞MCF-7；細胞增殖；細胞凋亡

〔中圖分類號〕R285.5；R273 〔文獻標志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.008

〔Abstract〕 Objective To study the effect of Shugan Jianpi Jiedu decoction on proliferation and apoptosis of human breast cancer cell line MCF-7. Methods The MCF-7 cells were intervened with drugs for 12 h， 24 h and 48 h （assigned into blank control group， positive drug control group and different concentrations of TCM groups）， then MCF-7 cells proliferation was detected by CCK8 method. The apoptosis rate of the cells was measured by flow cytometry after intervention with drugs for 36 h and 48 h. Results The absorbance of TCM groups was lower than that of the blank group， the difference was statistically significant （P<0.05）. The absorbance decreased gradually with the increase of drug concentration， and reduced gradually with the extension of time from 12 h to 24 h， while after 24 h， the absorbance between the high concentration TCM group and the positive control group was not statistically significant （P>0.05）. The cell apoptosis rate in TCM groups was higher than that in blank group， the difference was statistically significant （P<0.01）， but was significantly lower than that in positive group （P<0.01）. Conclusion Shugan Jianpi Jiedu decoction exhibits certain inhibitory effect on human breast cancer cell MCF-7 proliferation， and its mechanism maybe through inducing cell apoptosis.

〔Keywords〕 Shugan Jianpi Jiedu decoction； human breast cancer cell line MCF-7； cell proliferation； cell apoptosis

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。自2008年以來，乳腺癌的發(fā)病率增加20%以上，死亡率增加了14%[1]。乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，在我國發(fā)達城市，特別是在一些大城市及沿海經(jīng)濟發(fā)展較快的地區(qū)，已占女性惡性腫瘤發(fā)病的首位[2]，嚴重威脅著女性身體健康?！笆韪谓∑⒔舛痉健睘槲以褐委熑橄侔┑慕?jīng)驗方，經(jīng)多年臨床實踐，我們運用該方治療乳腺癌患者取得良好療效。為進一步明確其作用機理，我們進行了相關實驗研究[3]，本實驗進一步探討疏肝健脾解毒方提取液對人乳腺癌細胞MCF-7的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 細胞株及藥物

人乳腺癌細胞MCF-7由中南大學湘雅醫(yī)學院國家重點腫瘤研究所贈送；疏肝健脾解毒方由柴胡10 g，郁金10 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，蒲公英30 g組成。由湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院中藥房提供；陽性對照藥注射用鹽酸吡柔比星購自深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格：10 mg/瓶，國藥準字：H0930105，產(chǎn)品批號：1605C8。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，批號：8116293）；胎牛血清（PAN，批號：P160704）；0.25%胰蛋白酶（Gibco，批號：8252000）；CCK8（七海生物有限公司，批號20161106）；青霉素-鏈霉素混合液（Hyclone，批號：J160002）；磷酸鹽緩沖液（Hyclone，批號：AB218110）。細胞培養(yǎng)箱（Thermo，型號：HERAcell 2401）；超凈工作臺（法國 JouanMSC12）；高速離心機（湖南賽特湘儀，TG16-WS）；全自動酶標儀（BioTek，型號：EIX808U）；流式細胞分析儀（美國BD，型號：BD FACSCalibur）。

2 方法

2.1 藥物制備

疏肝健脾解毒方由柴胡10 g，郁金10 g，茯苓10 g，白術(shù)10 g，白花蛇舌草30 g，半枝蓮30 g，蒲公英30 g組成。取以上中藥處方劑，用10倍溫水浸泡0.5 h，大火加熱煎煮，水開后繼續(xù)煎煮0.5 h，趁熱過濾。藥渣再加8倍水煎煮2次，每次0.5 h，趁熱過濾。將3次水煎液混合、過濾，減壓濃縮為濃度為1 g/mL的溶液，在超凈工作臺內(nèi)以0.22 ？滋m微孔濾膜過濾除菌后，分裝于1.5 mL無菌EP管內(nèi)，4 ℃保存?zhèn)溆?。注射用鹽酸吡柔比星于生物安全柜內(nèi)用注射用無菌生理鹽水配制成1 mg/mL的溶液，分裝于1 mL無菌EP管內(nèi)，置于-20 ℃冰箱備用。將中藥及陽性對照藥溶液均于臨用前加入DMEM培養(yǎng)基配成所需濃度，并檢測配制液pH值及滲透壓，確保其pH值及滲透壓均保持在正常培養(yǎng)基的可波動范圍（pH7.2～7.4、滲透壓280～320 m·sm/kg），必要時用無菌HCL和NaOH調(diào)整溶液pH值，以無菌NaCl調(diào)整溶液滲透壓。

2.2 人乳腺癌細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞MCF-7，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%～90%時予以胰蛋白酶消化、傳代，約2～3 d傳代1次。

2.3 CCK8法檢測人乳腺癌細胞MCF-7增殖情況

取對數(shù)生長期的細胞，用胰蛋白酶消化后收集，用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為3×104/mL。從96孔板第2行第2列培養(yǎng)孔開始，每列取5孔，取8列，每1列為1組，分別設為空白對照組、中藥A組（5 mg/mL）、中藥B組（10 mg/mL）、中藥C組（15 mg/mL）、中藥D組（20 mg/mL）、中藥E組（25 mg/mL）、中藥F組（30 mg/mL）及陽性對照組（注射用鹽酸吡柔比星，參考相關文獻[4-5]及預實驗結(jié)果，濃度設為10 mg/L）。向每孔中加入100 ？滋L上述細胞懸液，4周培養(yǎng)孔均加入100 ？滋L磷酸鹽緩沖液，以防邊緣效應。將96孔板放于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。共接種96孔板3板，分別用于給藥后12、24、48 h檢測細胞增殖情況。

24 h后取出培養(yǎng)板，吸除培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，并按照分組情況向相應列的6個培養(yǎng)孔加入含相應濃度藥物的培養(yǎng)基100 ？滋L，最下方不含細胞的培養(yǎng)孔作為該組的調(diào)零孔，以排除藥液中色素等對檢測結(jié)果的影響。

給藥后12、24、48 h分別取1塊96孔板，分別向各實驗孔加入CCK8溶液10 ？滋L，輕輕震蕩，使CCK8溶液與培養(yǎng)液混勻，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，用酶標儀于570 nm波長下檢測各孔吸光值（OD值），計算各孔細胞生長抑制率（IR）。IR（%）=[（空白組OD值-空白調(diào)零孔OD值）-（給藥組OD值-給藥組調(diào)零孔OD值）]/（空白組OD值-空白調(diào)零孔OD值）×100%。

2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況

取對數(shù)生長期的細胞，調(diào)整濃度為1.5×105/mL，取6孔板2塊，每孔加入上述細胞懸液2 mL，分別設為空白組、中藥組（為保證給藥后有足夠細胞數(shù)用于流式檢測，結(jié)合增殖抑制情況，中藥濃度定為半數(shù)抑制率對應濃度：16 mg/mL）及陽性對照組（注射用鹽酸吡柔比星，因10 mg/L時，細胞增殖抑制率過高，為保證給藥后有足夠細胞數(shù)可用于流式檢測，此處濃度設為5 mg/L），每組2孔。細胞鋪板完成后將6孔板置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

給藥36 h及48 h后分別取出1塊6孔板，收集各實驗孔中的培養(yǎng)液于15 mL離心管中，以0.25%的胰蛋白酶消化細胞后，用磷酸鹽緩沖液吹打、收集細胞，移入離心管，將各組培養(yǎng)液及細胞懸液均以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清。用4 ℃預冷的磷酸鹽緩沖液清洗細胞沉淀2次，并合并同組培養(yǎng)液及細胞懸液離心所得細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用70%冰乙醇固定24 h。1 000 r/min離心5 min，棄上清，磷酸鹽緩沖液洗滌1次，每組加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞沉淀，于37 ℃避光溫浴30 min。染色完成后24 h內(nèi)（期間可以置于4 ℃或冰浴避光存放）用流式細胞儀在激光波長488 nm波長處檢測熒光強度及散射情況。

重復上述步驟3次，取平均值。

2.5 統(tǒng)計方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以“x±s”表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布及方差齊性時，兩組間比較采用獨立樣本T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法；數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布但方差不齊時，兩組間比較用Satterthwaite近似T檢驗，多組間比較采用近似T檢驗Welch法；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用？字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞增殖的影響

疏肝健脾解毒方對MCF-7增殖具有一定的抑制作用，抑制作用具有明顯的濃度依賴性；且12 h至24 h，隨著作用時間延長，抑制作用明顯增強，但24 h至48 h，時間依賴性不明顯，提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7增殖的抑制作用在24 h左右可接近峰值（P<0.05或P<0.01）。較高濃度中藥對MCF-7增殖抑制作用與陽性對照藥（注射用鹽酸吡柔比星10 mg/L）相當（P>0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

3.2 疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞凋亡的影響

與空白組比較，中藥組（16 mg/mL）MCF-7細胞晚期凋亡率較高，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞具有誘導凋亡的作用；但中藥組MCF-7細胞晚期凋亡率低于陽性對照組，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7的誘導凋亡作用不及陽性對照藥（注射用鹽酸吡柔比星5 mg/L）；同組藥物作用后48 h與36 h比較，細胞凋亡率增加，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)果見表2，圖2。

4 討論

乳腺癌，中醫(yī)稱之為“乳巖”“惡瘡” “失榮”等[6]。肝主疏泄，喜條達而惡抑郁，而乳腺癌患者多為中老年女性，更年期患者多見，常為肝郁體質(zhì)[7]。眾多醫(yī)家認為，乳腺癌多由郁怒傷肝、肝郁氣滯，又因思慮傷脾、脾失健運[8]，如明代《外科正宗》中所言：“憂郁傷肝，思慮傷脾，積慮在心，所愿不得者，致經(jīng)絡痞塞，積聚成核”。故其發(fā)病的關鍵是情志不遂，肝郁脾虛。肝失疏泄貫穿于乳腺癌發(fā)生發(fā)展的全過程[9-11]。健脾疏肝法成為治療乳腺癌及其相關并發(fā)癥的重要治則[12]。我們根據(jù)多年經(jīng)驗，認為肝郁脾虛是乳腺癌發(fā)病的重要原因之一，乳腺與肝、脾、腎及沖任二脈關系密切，并將乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展歸納為“瘀、毒、虛”，即：正氣虧虛， 瘀毒互結(jié)[13]?！笆韪谓∑⒔舛痉健笔俏以褐委熑橄侔┑慕?jīng)驗方，方由柴胡、郁金、茯苓、白術(shù)、半枝蓮、白花蛇舌草、蒲公英組成。該方以柴胡、郁金、茯苓、白術(shù)疏肝健脾，白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英清熱解毒。全方藥物配伍精要，疏肝健脾、清熱解毒、扶正抗癌，標本兼治。

本研究用CCK8法驗證了疏肝健脾解毒方提取液對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其對MCF-7細胞的增殖抑制作用較強，且藥物濃度、作用時間均與細胞增殖抑制率相關。較高濃度中藥對MCF-7細胞的增殖抑制作用與化療藥物（注射用鹽酸吡柔比星10 mg/L）相當。同時用流式細胞術(shù)檢測了疏肝健脾解毒方提取液對MCF-7細胞凋亡的影響。與空白組比較，疏肝健脾解毒方組MCF-7細胞晚期凋亡率較高，且差異有顯著統(tǒng)計學意義（P<0.01），提示中藥疏肝健脾解毒方對MCF-7細胞具有誘導凋亡的作用。因此疏肝健脾解毒方可能通過誘導細胞凋亡的方式抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖。本研究不但可佐證疏肝健脾解毒方的臨床療效確切，也為其在抗乳腺癌作用機制中的應用提供一定的科學依據(jù)。

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（本文編輯 楊 瑛）