張弦　周鑫　尹華　張昊霖　文菲　熊廣華　曹德良　廖端芳　傅榕賡

〔摘要〕 目的 基于分子對接探討水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ與代謝型谷氨酸受體5（metabotropic glutamate receptor 5， mglu5）之間的相互作用并測定化合物Ⅰ-Ⅳ的體外抗肝癌HepG2細胞增殖活性。方法 采用計算機軟件，以mglu5結(jié)晶復(fù)合物5CGD為受體模板，將水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ進行分子對接研究；利用MTT法測定水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ對肝癌HepG2細胞的增殖抑制活性。結(jié)果 水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ與mglu5的活性口袋產(chǎn)生疏水作用以及與活性口袋關(guān)鍵氨基酸殘基SER809產(chǎn)生氫鍵結(jié)合；水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ對肝癌細胞HepG2的抗增殖活性IC50值分別為2.55 μmol/L、3.99 μmol/L、3.12 μmol/L和7.55 μmol/L。結(jié)論 水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ與mglu5對接的結(jié)合信息有助于水楊酰苯胺類mglu5拮抗劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和新型mglu5拮抗劑設(shè)計，該類化合物的抗腫瘤作用值得進一步研究。

〔關(guān)鍵詞〕 水楊酰苯胺；代謝型谷氨酸受體5拮抗劑；對接；抗腫瘤

〔中圖分類號〕R284.3 〔文獻標(biāo)志碼〕A 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2018.06.002

〔Abstract〕 Objective To study the interaction between the salicylanilides I-IV with metabotropic glutamate receptor 5 （mglu5） based on molecular docking and their antitumor activity in vitro. Methods The molecular docking study of salicylanilides I-IV were performed by using mglu5 as a receptor template by in silica software. In vitro cytotoxicity of salicylanilides I-IV to human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was measured by a MTT method. Results It was found that salicylanilides I-IV interacted with mglu5 binding site by hydrophobic interaction and a key hydrogen bond with amino acid residue SER809. These interactions were closely related to biological activity. Compounds I-IV showed inhibitory effect on the proliferation of HepG2 cells with the IC50 values of 2.55 μM， 3.99 μmol/L， 3.12 μmol/L and 7.55 μmol/L， respectively. Conclusion The binding information of salicylanilides with mglu5 would be useful for modifying the structure and designing novel mglu5 antagonists. The antitumor activity of compounds of this type would be further studied.

〔Keywords〕 salicylanilide； mglu5 antagonist； docking； antitumor

代謝型谷氨酸受體5（metabotropic glutamate receptor 5， mglu5） 屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且在多種神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，mglu5不僅存在于腦組織，在許多外周器官和組織中也有表達，mglu5表達及活性的異常還與惡性腫瘤（如肝癌）的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[2]。因此，

mglu5已成為相關(guān)疾病新藥研究的熱門靶點。

mglu5拮抗劑代表骨架為二芳基類為主的直線型分子[3-4]，而水楊酰苯胺mglu5拮抗劑Ⅰ-Ⅳ（結(jié)構(gòu)如圖1所示）是我們課題組前期將水楊酰苯胺這一分子骨架與4-苯胺基喹唑啉類mglu5拮抗劑（代表化合物A）分子骨架進行骨架躍遷，設(shè)計合成得到的新型mglu5拮抗劑[5-6]。目前水楊酰苯胺類化合物Ⅰ-Ⅳ與mglu5相互作用，以及體外抗肝癌細胞增殖活性的研究均無文獻報道。由于mglu5的表達及活性異常與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，因此，本文通過對接研究揭示水楊酰苯胺類化合物與mglu5結(jié)合作用模式并初步測定了水楊酰苯胺類化合物Ⅰ-Ⅳ的體外抗肝癌增殖活性。

1 水楊酰苯胺類化合物Ⅰ-IV與mglu5結(jié)合模式研究

1.1 材料與方法

使用Tripos Benchware軟件繪制化合物Ⅰ-Ⅳ、MPEP以及化合物A的三維結(jié)構(gòu)，并對此三維結(jié)構(gòu)進行能量優(yōu)化、加氫、加電荷等預(yù)處理，將優(yōu)化好的分子保存為mol2格式文件備用。

1.2 受體準(zhǔn)備

所選取的mglu5的三維結(jié)構(gòu)文件來源于RSCB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB code：5CGD）。這一蛋白晶體由A、B兩條完全對稱的亞單元組成，其中還包含了配體HTL14242。在分子對接前，使用Tripos Benchware軟件對mglu5蛋白進行加氫、加電荷、去配體、去水分子等預(yù)處理，并保存為mol2文件格式備用。

1.3 分子對接方法和原理

Gold是一款由英國劍橋大學(xué)晶體數(shù)據(jù)中心開發(fā)的一款分子對接程序，采用遺傳算法（GA）進行蛋白-配體柔性對接，從而計算大分子與小分子結(jié)合模式，具有精度高、可靠性高以及操作界面友好等特點。

對接定義活性口袋設(shè)定以HTL14242半徑5？魡以內(nèi)的氨基酸殘基組成的活性口袋，即由ILE625、ILE651、SER654、PRO655、SER658、TYR659、ASN747、THR781、ILE784、TRP785、PHE788、VAL806、SER805、SER809、ALA810氨基酸殘基構(gòu)成。

Gold程序借用遺傳算法將化合物Ⅰ-Ⅳ、MPEP、化合物A與mglu5對接，充分搜索構(gòu)象空間，以找到分子相互作用的最優(yōu)模式。Gold程序提供了多種相互作用打分，用擬合度（GoldScore Fitness）函數(shù)表示。根據(jù)擬合度函數(shù)值的大小判斷分子對接的好壞，函數(shù)值越大則分子間相互作用越強，形成的復(fù)合物能量越低，越穩(wěn)定。在Gold對接過程中不允許提前結(jié)束對接，對接過程中配體構(gòu)象可翻轉(zhuǎn)。如無特別說明，所有參數(shù)均采用Gold 3.0默認值。

2 化合物Ⅰ-Ⅳ體外抗肝癌HepG2細胞增殖活性

取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的為HepG2肝癌細胞（來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心）加入0.25%胰酶蛋白消化，使貼壁細胞脫落，制成細胞懸液，密度為5×104個/mL。分別以100 μL/孔，每孔5×103個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中。置37 ℃，5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。吸棄上清，然后分別加入200 μL不同濃度（0.1 μmol/L至25 μmol/L）的目標(biāo)化合物，每組設(shè)8個復(fù)孔。培養(yǎng)72 h后，再加入5 mg/mL的MTT 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸棄上清，加入DMSO 150 μL/孔，微振蕩器上振蕩10 min，將試劑對照調(diào)零，用自動酶標(biāo)儀在550 nm波長處測出細胞對照組和各藥物組的吸收度，取各組均值，并計算細胞抑制率。計算化合物對細胞的抑制率（IR）。IR=[1-（實驗孔OD值-空白孔OD值）/（對照孔OD值-空白孔OD值）]×100%，計算IC50值，使用軟件Grapipad Prism 5.0擬合計算得到。

3 結(jié)果與討論

化合物Ⅰ-Ⅳ與mglu5活性口袋對接結(jié)果如表1所示，函數(shù)值越大則分子間相互作用越強，形成的復(fù)合物能量越低，相對越穩(wěn)定。

3.1 MPEP與mglu5結(jié)合模式分析

將MPEP對接到mglu5活性口袋中，如圖2所示：MPEP在mglu5活性口袋中分別與關(guān)鍵的氨基酸殘基SER809形成一個氫鍵，氫鍵鍵長為1.879×10-10 m。

MPEP結(jié)構(gòu)中的A環(huán)進入mglu5活性口袋中由TRP785、PHE788、ILE651、VAL806、SER805等形成的疏水腔，TRP785的苯環(huán)結(jié)構(gòu)能夠與MPEP產(chǎn)生π-π堆積作用，對MPEP構(gòu)象的穩(wěn)定起到一定作用；MPEP結(jié)構(gòu)中B環(huán)作用于另一疏水腔。在橫跨活性口袋方向，ILE625、PHE788的位阻限制了化合物的長度。

3.2 化合物A與mglu5結(jié)合模式分析

如圖3所示，將化合物A對接到mglu5活性口袋中，其在mglu5活性口袋中與一個關(guān)鍵的氨基酸殘基SER809形成一個氫鍵，長度為1.792×10-10 m。

化合物A結(jié)構(gòu)中的A環(huán)進入mglu5活性口袋中由TRP785、PHE788、ILE651、VAL806、SER805等形成的疏水腔，A環(huán)上的胺基作為氫鍵供體與關(guān)鍵的氨基酸殘基SER809形成氫鍵?；衔顰結(jié)構(gòu)中的喹啉環(huán)剛性較強，分子趨于平面構(gòu)象。

3.3 化合物Ⅰ與MPEP在mglu5活性口袋結(jié)合模式比較

鑒于化合物MPEP是代表性的mglu5拮抗劑工具藥，如圖4所示，首先將化合物Ⅰ與MPEP對接到mglu5活性口袋中，二者的苯環(huán)重疊性較好，均作用于mglu5的疏水口袋；化合物Ⅰ的酰胺結(jié)構(gòu)和MPEP的碳碳三鍵結(jié)構(gòu)的長度相近，兩者都能與關(guān)鍵的SER809形成氫鍵。不同之處在于化合物Ⅰ和MPEP在與SER809形成氫鍵時分別提供氫鍵受體和氫鍵供體。結(jié)合體外活性結(jié)果，推測二者氫鍵產(chǎn)生的方式不同。

3.4 化合物Ⅰ與化合物A在mglu5活性口袋結(jié)合模式比較

如圖5所示，將化合物Ⅰ與化合物A對接到mglu5活性口袋中，化合物Ⅰ的兩個苯環(huán)與化合物A中的兩個苯環(huán)在口袋中疊合較好，均作用于關(guān)鍵的疏水口袋，且兩化合物都能通過胺基與SER809形成氫鍵。從對接結(jié)果看，化合物A的水楊酰苯胺結(jié)構(gòu)中的羥基與羰基通過分子內(nèi)氫鍵形成的“假”六元環(huán)構(gòu)型能夠很好的模擬化合物A中的喹啉結(jié)構(gòu)。區(qū)別在于：喹啉環(huán)相對于水楊酰胺結(jié)構(gòu)剛性強，而所設(shè)計的水楊酰苯胺化合物沒有類似剛性結(jié)構(gòu)的約束。上述對接結(jié)果也驗證了設(shè)計思想的可行性，即將4-苯胺基喹啉結(jié)構(gòu)通過骨架躍遷水楊酰苯胺結(jié)構(gòu)，可以具有類似的作用模式。

3.5 化合物Ⅰ和化合物Ⅱ在mglu5活性口袋結(jié)合模式比較

如圖6所示，將化合物Ⅰ與化合物Ⅱ?qū)拥?/p>

mglu5活性口袋中。兩者的芳環(huán)均作用于mglu5的疏水腔中，差異在于：與化合物Ⅰ相比，由于化合物Ⅱ的苯胺3碳位置上的氯原子被體積較大的三氟甲基取代，使得化合物Ⅱ與疏水腔存在一定的空間位阻，從某種程度上影響了化合物與mglu5產(chǎn)生氫鍵的強度，對接打分值與實測值正相關(guān)，即對mglu5拮抗活性化合物Ⅰ強于化合物Ⅱ（如表1所示）。

3.6 化合物Ⅲ和化合物Ⅰ在mglu5活性口袋結(jié)合模式比較

如圖7所示，將化合物Ⅰ與化合物Ⅲ對接到mglu5活性口袋中。由于化合物Ⅰ與化合物Ⅲ在取代基上有較大的差異（化合物Ⅲ苯環(huán)上5位為溴原子，苯胺的取代基為2-氯-4-三氟甲基），使得化合物Ⅲ的作用模式與化合物Ⅰ有較大的差異：化合物Ⅲ有體積較大的三氟甲基且在苯胺的4位，使得整個化合物的長度增加，由于PHE788的大位阻的存在，使化合物Ⅲ結(jié)合構(gòu)象產(chǎn)生了較大的偏移，結(jié)果使得其不能與mglu5活性口袋中的關(guān)鍵氨基酸殘基SER809產(chǎn)生氫鍵。

3.7 化合物Ⅳ和化合物Ⅰ在mglu5活性口袋結(jié)合模式比較

如圖8所示，將化合物Ⅰ與化合物Ⅳ對接到mglu5活性口袋中。由于化合物Ⅳ結(jié)構(gòu)中苯胺上4位為較長的氰基，而活性口袋長度有限，使得化合物IV在口袋中的結(jié)合構(gòu)象同樣產(chǎn)生了較大的傾斜，不僅降低了其在疏水腔中產(chǎn)生的疏水作用，而且使得其不能靠近關(guān)鍵的氨基酸殘基SER809產(chǎn)生氫鍵。因此，在活性上化合物Ⅳ對mglu5的拮抗活性遠低于化合物Ⅰ。

3.8 化合物Ⅰ-Ⅳ對肝癌HepG2細胞增殖的影響

目標(biāo)化合物Ⅰ-Ⅳ對肝癌細胞HepG2具不同程度的抗增殖活性，IC50值分別為2.55 μmol/L、3.99 μmol/L、3.12 μmol/L和7.55 μmol/L。目標(biāo)化合物體外抗HepG2增殖實驗結(jié)果與mglu5拮抗活性具有一定的正相關(guān)性，即化合物Ⅰ活性在4個目標(biāo)化合物中抗增殖活性最強，化合物Ⅳ抗增殖活性最差。見表2。

4 結(jié)論

本課題組前期設(shè)計合成的水楊酰苯胺化合物Ⅰ-Ⅳ，通過與mglu5的活性口袋產(chǎn)生疏水作用以及與活性口袋關(guān)鍵氨基酸殘基SER809產(chǎn)生氫鍵作用，從而拮抗mglu5，并對HepG2細胞增殖產(chǎn)生抑制，符合文獻[2]報道的mglu5的表達與HepG2細胞增殖正相關(guān)這一規(guī)律。對接研究發(fā)現(xiàn)：水楊酰苯胺取代基的種類、個數(shù)以及取代位置對mglu5拮抗活性有較大影響，此結(jié)合模式提供的信息將為針對mglu5這一靶點設(shè)計抗腫瘤新化合物提供新方向。

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（本文編輯 蘇 維）