劉鑫

摘 要：主要對大型突變體文庫、全長cDNA文庫兩方面進(jìn)行介紹，并舉例說明對作物遺傳改良有影響的一些進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：水稻；突變體文庫；全長cDNA文庫

1 突變體文庫

通過敲除、抑制、過表達(dá)和異位表達(dá)，從而改變基因的表達(dá)水平或模式，這是破譯基因功能的常用策略之一。因此，構(gòu)建飽和突變體文庫對于基因功能的鑒定是必不可少的。目前，不同國家的許多實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)利用多種策略（包括T-DNA、轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子插入）開發(fā)了突變體文庫，其材料和相關(guān)數(shù)據(jù)正在迅速積累當(dāng)中。

除了敲除或抑制基因的表達(dá)外，這種文庫還可用于揭示標(biāo)記基因的表達(dá)模式。T-DNA和轉(zhuǎn)座子可通過添加功能元件，如激活標(biāo)簽、基因捕獲標(biāo)簽、啟動子捕獲標(biāo)簽和增強(qiáng)子捕獲標(biāo)簽等進(jìn)行修飾。例如，Wu等人[1]采用了3種水稻基因組功能分析策略構(gòu)建了突變體文庫，其中包括插入誘變、增強(qiáng)子誘捕和異位表達(dá)。插入誘變是突變體文庫的共同特征。許多增強(qiáng)子捕獲系統(tǒng)已經(jīng)使用了GAL4-VP16元件，當(dāng)T-DNA插入增強(qiáng)子附近時(shí)，GAL4-VP16將被表達(dá)，并且GAL4-VP16將與UAS結(jié)合，促使報(bào)道基因GUS或GFP的轉(zhuǎn)錄。對于異位表達(dá)，需要產(chǎn)生目標(biāo)系，且靶基因?qū)⒂蒛AS啟動子驅(qū)動表達(dá)。當(dāng)模式系與效應(yīng)系雜交時(shí)，GAL4-VP16可以與UAS結(jié)合，從而指導(dǎo)目的基因的表達(dá)。結(jié)果表明，該系統(tǒng)在異位表達(dá)檢測基因功能方面效果很好。因此，除了插入引起功能缺失突變以外，增強(qiáng)子誘變突變體文庫還可以提供一系列組織特異性表達(dá)株系，用于多種目的[2]。

研究者們[3]投入了大量的工作來分離插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，以提供插入標(biāo)簽（側(cè)翼序列標(biāo)簽，F(xiàn)ST）。使用的手段包括熱不對稱交錯(cuò)（TAIL）-PCR、反向PCR和銜接頭PCR。盡管T-DNA轉(zhuǎn)化株系總數(shù)很大，然而由于FST序列分離速度緩慢，側(cè)翼序列數(shù)據(jù)庫的完善仍有很長的路要走。

合成、管理、維護(hù)和篩選如此龐大的文庫，其復(fù)雜程度是十分巨大的。此外，T-DNA的非隨機(jī)分布發(fā)生在不同層次的基因組結(jié)構(gòu)上，偏向于大片段染色體而在TE相關(guān)序列插入頻率低，優(yōu)先發(fā)生在基因的5'-上游和3'-下游區(qū)域，且差異出現(xiàn)在某些類別的功能基因中。這種分布模式導(dǎo)致T-DNA插入途徑在獲取某些基因組區(qū)域和恢復(fù)某些類型的基因方面有較大的困難。因此，更有效的替代方法有待繼續(xù)探索。

除T-DNA插入之外，化學(xué)和物理誘變也可以為構(gòu)建飽和突變體文庫提供途徑。如今新的測序技術(shù)提高了識別突變位點(diǎn)的能力，使其可行性大大提升。RNA干擾技術(shù)是另外一個(gè)方法，該方法通過人造miRNAs沉默靶基因從而產(chǎn)生缺失突變體，它們多具有組織特異性或可誘導(dǎo)性[4]。這種方法的一個(gè)好處是僅僅需要很少的突變株就能獲得基因組的飽和突變。

2 全長cDNA文庫

通過全長cDNA文庫提供的信息，可以鑒定轉(zhuǎn)錄單位、內(nèi)含子、外顯子、可能的啟動子以及預(yù)測的基因產(chǎn)物，從而極大地幫助基因組序列的注釋。此外，全長cDNA文庫可以提供經(jīng)常用于基因分離的基因克隆的目錄，從而節(jié)省相當(dāng)大的工作量，促進(jìn)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

研究工作者們在收集全長cDNA克隆工作中已經(jīng)取得兩個(gè)大的進(jìn)展。在粳稻的研究方面，Kikuchi等人[5]通過從粳稻品種日本晴文庫中收集全長cDNA克隆起始了這項(xiàng)工作。目前，已經(jīng)分離出的全長cDNA克隆序列可以通過檢索水稻分子生物學(xué)百科全書數(shù)據(jù)庫獲得。在秈稻工作中，研究人員已經(jīng)從秈稻品種廣陸矮4號和明恢63號中分離出20 000多個(gè)全長cDNA克隆，科研人員可以通過搜索秈稻cDNA數(shù)據(jù)庫獲取這些克隆。另外，這些秈稻、粳稻和野生稻的全長cDNA克隆也為比較基因組學(xué)的發(fā)展提供了重要資源。

參考文獻(xiàn)：

[ 1 ] Wu C，Li X，Yuan W，et al. Development of enhancer trap lines

for functional analysis of the rice genome[J]. The Plant Journal，

2003，35（03）： 418-427.

[ 2 ] Liang D，Wu C，Li C，et al. Establishment of a patterned GAL4-VP16

transactivation system for discovering gene function in rice[J].

The Plant Journal，2006，46（06）：1 059-1 072.

[ 3 ] Zhang J，Guo D，Chang Y，et al. Non-random distribution of T-

DNA insertions at various levels of the genome hierarchy as revealed

by analyzing 13 804 T-DNA flanking sequences from an enhancer-

trap mutant library[J]. The Plant Journal，2007，49（05）：947-959.

[ 4 ] 肖景華，吳昌銀，張啟發(fā). 水稻功能基因組研究進(jìn)展與發(fā)展展

望[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2013，15（02）：1-7.

[ 5 ] Kikuchi S，Satoh K，Nagata T，et al. Col-

ection， mapping，and annotation of over

28 000 cDNA clones from japonica rice[J].

Science，2003，301（5631）： 376-379.

（收稿日期：2018-07-17）