周珊瑤 陳睿 譚夕 佘燕玲 雷斯

【摘要】目的探討Necrostatin1（Nec1）在二氯化鈷（CoCl2）誘導缺氧的條件下對骨骼肌細胞損傷修復的保護作用。方法采用小鼠骨骼肌C2C12成肌細胞為體外模型，CoCl2誘導缺氧，Nec1為缺氧保護劑。將培養(yǎng)分化72h后的細胞分為4組，分別加入等量培養(yǎng)基（Control組）、200μMCoCl2（CoCl2組）、150μMNec1（Nec1組）、200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1組），于光鏡下觀察不同處理組細胞的肌管形態(tài)，采用蛋白免疫印跡技術檢測肌細胞生成素（Myog）、肌細胞增強因子2A（MEF2A）蛋白表達的變化，統(tǒng)計細胞周期S期比例，劃痕實驗觀察細胞的損傷修復能力。結果CoCl2可誘導肌細胞形態(tài)異常，減少肌管分化，與Control組比較，CoCl2組Myog、MEF2A蛋白表達量降低（P均<001），同時，S期細胞比例下降（P<001），劃痕面積修復能力下降（P均<001）。加入Nec1干預后，細胞形態(tài)恢復，肌管分化增多，與CoCl2組比較，CoCl2+Nec1組Myog、MEF2A蛋白表達量及S期細胞比例上調(diào)（P均<005），細胞劃痕面積恢復（P<005）。結論CoCl2模擬缺氧可抑制肌細胞增殖、分化功能，導致肌細胞損傷修復能力下降。Nec1可增強缺氧條件下肌細胞的增殖和分化能力，對肌細胞的損傷修復有保護作用，可能通過抑制程序性壞死來促進肌細胞的損傷修復。

【關鍵詞】二氯化鈷；缺氧；C2C12；Necrostatin1；損傷修復

EffectofNec1onrepairofskeletalmusclecellinjuryundersimulatedhypoxiaZhouShanyao，ChenRui，TanXi，SheYanling，LeiSiGuangdongTraditionalMedicalandSportsInjuryRehabilitationResearchInstitute，GuangdongSecondProvincialGeneralHospital，Guangzhou510317，China

Correspondingauthor，ChenRui，Email：ruicmed@163com

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectofNecrostatin1（Nec1）ontherepairofskeletalmusclecellinjuryundersimulatedhypoxiainducedbyCobaltouschloride（CoCl2）MethodsInthisstudy，mouseskeletalmuscleC2C12cellswereusedasaninvitromodel，CoCl2wasutilizedtoinducehypoxiaandNec1wasutilizedasahypoxicprotectiveagentFollowingcultureandisolationfor72h，thecellsweredividedinto4groups，whichweresupplementedwithanequalvolumeofculturemedium（controlgroup），200μMCoCl2（CoCl2group），150μMNec1（Nec1group），and200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1group），respectivelyThemorphologyofmyotubeswasobservedunderlightmicroscopeThechangesoftheexpressionlevelsofmyogenin（Myog），myocyteenhancerfactor2A（MEF2A）proteinswerequantitativelydetectedbyWesternblottingTheproportionofcellsintheSphasewasstatisticallycalculatedWoundhealingassaywasadoptedtoevaluatetheabilityofcelldamagerepairResultsCoCl2couldinducethemyoblastabnormalitiesanddecreasedthedifferentiationofmyotubesComparedwiththecontrolgroup，theexpressionlevelsofMyogandMEF2Aproteinsweresignificantlydownregulated（bothP<001），theproportionofSphasecellsandtherepairabilityweresignificantlydecreasedintheCoCl2group（bothP<001）FollowingtheNec1intervention，thecellularmorphologywasrestoredandthedifferentiationofmyotubeswasenhancedComparedwiththeCoCl2group，theexpressionlevelsofMyogandMEF2AproteinsandtheproportionofSphasecellsweresignificantlyupregulated（bothP<005），andtheareaofcellscarwassignificantlyrestored（P<005）afterthesupplementofNec1ConclusionsCoCl2simulatedhypoxiacaninhibittheproliferationanddifferentiationofmyocytes，leadingtodecreasedabilityofcellinjuryrepairNec1canenhancetheproliferationanddifferentiationofmyocytesandprotectmyocytesfrominjuryunderhypoxicconditionsandpromotetheinjuryrepairofmyocytesbysuppressingprogrammednecrosis

【Keywords】CoCl2；Hypoxia；C2C12；Necrostatin1；Injuryrepair

氧在細胞呼吸和能量代謝中起著重要的作用。臨床上，運動性損傷、缺血缺氧性疾病或組織炎癥性改變常伴隨氧灌注不足或攝氧障礙，低氧環(huán)境可使組織功能進一步下降、甚至發(fā)生萎縮或變性壞死[12]。近年來，程序性壞死（Necroptosis）作為非凋亡的細胞死亡信號途徑成為缺血缺氧性損傷研究的新熱點，越來越多研究者發(fā)現(xiàn)，程序性壞死在多系統(tǒng)缺血缺氧性損傷后的炎癥反應、損傷修復過程中發(fā)揮重要作用[3]。相關研究表明，受體交互作用蛋白激酶1（RIP1）特異性抑制劑——壞死性凋亡抑制劑Necrostatin1（Nec1）能顯著改善缺血缺氧性損傷，對細胞、組織的增殖分化、損傷修復功能有保護作用[46]。但筆者見Nec1在骨骼肌缺氧損傷修復中作用的相關報道很少，故利用小鼠骨骼肌C2C12成肌細胞構建缺氧細胞模型，觀察缺氧對肌細胞的影響及Nec1的保護作用。

材料與方法

一、主要儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），光學電子顯微鏡（美國LifeTechnologies公司），流式細胞儀（美國BeckmanCoulter公司），電泳轉印系統(tǒng)（北京凱元信瑞儀器有限公司），化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。C2C12小鼠骨骼肌細胞系購于中國科學院干細胞庫，高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清、馬血清（美國Hyclone公司）。二氯化鈷（CoCl2）、Nec1（德國Sigma公司）。細胞周期檢測試劑盒、電化學發(fā)光（ECL）試劑盒（江蘇凱基生物技術有限公司）。肌細胞生成素（Myogenin，Myog）一抗（德國MerckMillipore公司）。肌細胞增強因子2A（MEF2A）一抗（美國CST公司）。Tubulin一抗、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔（美國ABclonal公司）。

二、實驗方法

1細胞培養(yǎng)

將C2C12小鼠骨骼肌細胞系置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，隔日換液，觀察細胞形態(tài)和生長情況。當細胞達到90%～100%融合時吸去完全培養(yǎng)液，使用含2%馬血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進行誘導分化，隔日換液。分化72h后將細胞分為4組，分別加入等量培養(yǎng)基（Control組）、200μMCoCl2（CoCl2組）、150μMNec1（Nec1組）、200μMCoCl2+150μMNec1（CoCl2+Nec1組）。48h后收集細胞，進行后續(xù)實驗。

2光學顯微鏡下觀察肌管融合情況

加入CoCl2、Nec1處理48h后，在40倍光學顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、肌管融合情況。

3細胞劃痕實驗

采用Maeker筆在培養(yǎng)板底部均勻劃線做標記，控制細胞數(shù)為5×105個，待細胞生長至90%時，用200μl槍頭沿標記線垂直劃痕，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗3次，去除劃痕損傷后不貼壁的細胞，重新加入相應培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，采用顯微鏡拍照記錄不同時間段劃痕面積，使用ImageJ軟件統(tǒng)計劃痕面積。

4細胞周期

用2%胰酶消化、離心、收集細胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，制成單細胞懸液。加入70%冷乙醇500μl固定2h，用PBS洗去固定液，加入500μl碘化丙啶/核糖核酸酶A（PI/RNaseA）染色工作液，避光室溫孵育60min。應用PI染色法流式細胞分析不同處理下的C2C12細胞周期變化。

5蛋白免疫印跡檢測

細胞培養(yǎng)板中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸蛋白酶抑制劑的細胞組織（RIPA）裂解液，于冰上裂解30min，4℃，12000轉/分離心10min。用二喹啉甲酸（BCA）法檢測蛋白含量。取30μg蛋白，進行電泳，再將蛋白電轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，室溫封閉1h。加入一抗于4℃孵育過夜。洗膜5次后于室溫孵育二抗。洗膜5次后，使用ECL液顯色，用天能系列全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。以Tubulin作為內(nèi)參，目的蛋白條帶與內(nèi)參比較作為條帶的相對表達值。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS210對數(shù)據(jù)進行分析，同時用GraphPadPrism50進行繪圖。重復3次實驗數(shù)據(jù)，計量資料采用±s表示，正態(tài)分布的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSDt檢驗，以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、Nec1、CoCl2對C2C12細胞肌管形成的影響

實驗中，Control組、Nec1組肌細胞分化情況良好，可見大量長條狀肌管形成。經(jīng)CoCl2處理后，分化停滯，肌管萎縮、斷裂，少見長條狀肌管形成。而加入CoCl2+Nec1處理后，可見細胞分化情況較CoCl2組改善，肌管形成增多，見圖1。

二、Nec1、CoCl2對Myog、MEF2A表達水平的影響

CoCl2處理可誘導肌生成、分化標志基因Myog、MEF2A蛋白表達下降（P均<001），加入Nec1處理后，可逆轉CoCl2的抑制作用，上調(diào)Myog（P<005）及MEF2A的表達（P<0001），見圖2、表1。

三、Nec1、CoCl2對細胞周期的影響

結果顯示，CoCl2組[（1247±106）%]和CoCl2+Nec1組[1889±352）%]S期細胞比例均較Control組[（3569±267）%]少（P均<0001），但CoCl2+Nec1組較CoCl2組多（P=0039），見圖3。

四、Nec1、CoCl2對C2C12細胞劃痕愈合的影響

實驗結果顯示，不同處理組的劃痕愈合程度不同，見圖4。隨時間推移，劃痕面積逐漸縮小，Control組、Nec1組及CoCl2+Nec1組愈合速度較快，在72h時幾乎完全愈合，而CoCl2組愈合速度相對較慢。

實驗結果采用單因素方差分析，對比各個時間點不同處理組之間的變化差異。在0h時，各處理組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>005）；在24、48、72h時，CoCl2組細胞劃痕損傷面積均大于Control組、Nec1組（P均<0001）；而加入Nec1處理逆轉了CoCl2引起的細胞損傷，CoCl2+Nec1組劃痕損傷面積減小，劃痕愈合程度較CoCl2組高（P<0001），見表2、圖5。

討論

本研究采用CoCl2模擬低氧環(huán)境，觀察小鼠C2C12成肌細胞的變化。CoCl2是常用的缺氧模擬化合物，在組織中通過鈷離子競爭血紅蛋白卟啉環(huán)中的鐵離子，抑制氧合血紅蛋白的形成而喪失與氧結合的能力，在細胞中通過抑制脯氨酰羥化酶的羥化作用，從而誘發(fā)一系列類似缺氧反應，在細胞增殖、分化以及損傷應激研究中被廣泛應用[78]。

通過CoCl2模擬缺氧后，可觀察到肌細胞形態(tài)學異常，肌細胞的分化標志物Myog和MEF2A表達下調(diào)。Myog屬于生肌調(diào)節(jié)因子（MRF）家族成員，具有控制成肌細胞融合的起始，促使成肌細胞增殖，促進單核成肌細胞轉變?yōu)槎嗪思±w維的作用，是肌細胞終末分化的決定因素[9]。本課題組的前期研究也顯示，MRF的表達對肌細胞的分化、融合有重要的作用[10]。Myog具有堿性螺旋環(huán)螺旋（bHLH）結構，MEF2的MADSbox區(qū)域可與bHLH相互作用，從而激活Myog的表達，進而實現(xiàn)對骨骼肌發(fā)育的調(diào)控。本研究結果提示，CoCl2模擬缺氧可抑制肌細胞的分化。

缺氧可使多種細胞生長停滯，并使其代謝、功能和形態(tài)結構發(fā)生異常變化，并出現(xiàn)凋亡、壞死、自噬、程序性壞死等[78，11]。本研究結果顯示，CoCl2誘導可導致細胞周期阻滯，劃痕損傷修復能力減弱，推測缺氧對細胞增殖有抑制作用。此外，亦有文獻報道，短時間或低劑量的缺氧環(huán)境可激活細胞應激保護機制，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉化生長因子β1（TGFβ1）等因子的表達量，減少細胞凋亡、加速細胞增殖分化，促進修復[1213]。

近年來，程序性壞死是細胞死亡領域新的研究熱點，具有壞死的細胞形態(tài)特點和自噬的活化，主動耗損能量，且能被一系列信號傳導通路高度調(diào)控[14]。有研究表明，CoCl2誘導缺氧能使程序性壞死活化[1516]。Nec1是程序性壞死的特異性抑制劑，文獻報道Nec1可改善缺血缺氧損傷，通過抑制程序性壞死對缺血缺氧模型的腦、肝、心肌組織具有保護作用，減少病理損傷，促進組織的損傷修復，對臨床治療指導意義重大[14，1719]。本研究結果顯示，與CoCl2處理組相比，加入Nec1干預能使細胞形態(tài)恢復正常，Myog、MEF2A蛋白表達水平上調(diào)，S期細胞比例上升，劃痕實驗后的損傷面積修復能力改善，說明Nec1在缺氧條件下對骨骼肌細胞增殖分化有保護作用。由此推測，Nec1可能通過抑制肌細胞程序性壞死的發(fā)生，從而逆轉缺氧狀態(tài)對細胞增殖分化的損害。

綜上所述，CoCl2模擬缺氧可誘導肌細胞損傷，抑制其增殖、分化功能，Nec1對缺氧條件下的肌細胞損傷修復有保護作用，可能通過抑制程序性壞死來促進肌細胞的損傷修復。然而，本研究僅驗證了Nec1對化學誘導缺氧下的骨骼肌細胞具有保護作用，缺乏對物理缺氧模型的研究，未來將在后續(xù)的研究中進一步探討其在物理缺氧的體內(nèi)外模型的作用，研究Nec1的藥理作用及機制，為肌組織缺氧損傷相關疾病的治療提供理論依據(jù)。

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