張麗娟 劉永紅 古同男 鐘家亮

中圖分類號 R943；R361+.3 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）07-0906-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.07.10

摘 要 目的：制備精氨白樺脂酸，并考察其對三陰性人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響。方法：以精氨酸為增溶載體，采用共研磨法將等摩爾比的白樺脂酸與精氨酸制成精氨白樺脂酸。采用粉末X射線衍射法、紅外光譜法、差示掃描量熱法對精氨白樺脂酸進行表征；比較白樺脂酸和精氨白樺脂酸的溶解度；采用MTT法檢測15、30、60、120 μg/mL的白樺脂酸、精氨白樺脂酸和5氟尿嘧啶（5-FU）對MDA-MB-231細胞增殖的影響。結(jié)果：所制精氨白樺脂酸為不同于精氨酸與白樺脂酸物理疊加的新的物相，其中白樺脂酸的羧基與精氨酸中氨基進行了成鹽反應(yīng)，其未見明顯的熔點峰。白樺脂酸幾乎不溶于水，精氨白樺脂酸水溶液中白樺脂酸的溶解度為50.72 μg/mL。與白樺脂酸比較，精氨白樺脂酸對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率明顯升高（P<0.05），且與5-FU比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：成功制得溶解度較好的精氨白樺脂酸，其對MDA-MB-231細胞的增殖具有抑制作用。

關(guān)鍵詞 精氨白樺脂酸；表征；增溶；三陰性人乳腺癌細胞MDA-MB-231；增殖抑制

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare argininate betulinic acid， and to investigate the effect of the proliferation of triple-negative human breast cancer cell MDA-MB-231. METHODS： By using argininate as the solubilization carrier， argininate betulinic acid was prepared by co-grinding equal molar ratio of betulinic acid and argininate. The argininate betulinic acid was characterized with powder X-ray diffractometry， infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry. The solubility of betulinic acid and argininate betulinic acid were compared. MTT method was used to assay the effects of 15， 30， 60， 120 μg/mL betulinic acid， argininate betulinic acid and 5-FU on the proliferation of MDA-MB-231 cell. RESULTS： Prepared argininate betulinic acid was a new phase which was different from the physical mixing of argininate and betulinic acid， among which carboxyl group of betulinic acid and amino group of argininate formed as a salt， and the salt had no obvious melting peak. Betulinic acid was almost insoluble in water. The solubility of betulinic acid in argininate betulinic acid aqueous solution was 50.72 μg/mL. Compared with betulinic acid， the inhibitory rate of argininate betulinic acid on the growth of MDA-MB-231 cell was increased significantly （P<0.05）， there was no statistical significance between its effect and 5-FU （P>0.05）. CONCLUSIONS： Argininate betulinic acid with good solubility is prepared successfully， and can inhibit the proliferation of MDA-MB-231 cell.

KEYWORDS Argininate betulinic acid； Characterization； Solubilization； Triple-negative human breast cancer cell MDA-MB- 231； Proliferation inhibition

天然藥物分子多數(shù)存在相對分子質(zhì)量大、溶解性差等問題，在胃腸道溶解速率較慢，導(dǎo)致其口服吸收差、生物利用度低，阻礙了難溶性天然藥物的臨床應(yīng)用。有多種方法[1-4]可用于解決藥物的水難溶性和低溶解速率等問題，其中成鹽是增加難溶性弱酸、弱堿藥物溶解度最常用的方法[5-6]。成鹽可改善藥物的部分理化性質(zhì)，包括熔點、溶解度、溶出速率、穩(wěn)定性、吸濕性以及生物利用度等。

全球乳腺癌發(fā)病率自20世紀70年代末開始一直呈上升趨勢。近年我國乳腺癌發(fā)病率的增長速度高出高發(fā)國家1～2個百分點，并且趨于年輕化，嚴重危害婦女健康，其中以三陰性乳腺癌最為顯著[7]，已成為當前社會的重大公共衛(wèi)生問題，因此尋找新型抗腫瘤藥物意義重大。據(jù)不完全統(tǒng)計，來源于天然藥物的抗癌制劑約占抗癌藥物的三分之一[8]，因此從天然藥物中尋找新型抗腫瘤藥物具有廣闊的前景。白樺脂酸（Betulinic acid）為自然界常見的羽扇烷型五環(huán)三萜類（PCTT）化合物[9]，廣泛分布于白樺樹、夏枯草、木瓜、迷迭香、夾竹桃、白頭翁、赤楠等多種植物中，主要從白樺樹皮中提取獲得。白樺脂酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗血小板聚集、抗腦缺血、保肝等活性[10-11]，尤其是近年來發(fā)現(xiàn)的白樺脂酸具有抗腫瘤和抗人類免疫缺陷病毒（HIV）活性引起了廣泛關(guān)注[12-14]。白樺脂酸可溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，但難溶于水，限制了其臨床應(yīng)用。

通常，水溶性較大的藥物在胃腸液中的溶出速率較快。氨基酸作為藥物載體，被廣泛用于藥物的增溶研究，Jeong HJ等[15]通過制備白樺脂酸的甘氨酸甲酯復(fù)合物，再水解生成白樺脂酸/甘氨酸結(jié)合物，增加了白樺脂酸的溶解度，促進了其對人黑色素瘤細胞MEL-2的細胞毒作用。本研究則利用精氨酸的堿性氨基與白樺脂酸的羧酸成鹽的特性，采用機械化學法制備獲得精氨白樺脂酸，并考察其對三陰性人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響。

1 材料

1.1 儀器

MM400型球磨機（德國Retch公司）；TU1901型雙光束紫外分光光度儀（北京普析通用儀器有限公司）；D8 Advance型粉末衍射儀（德國Bruker公司）；5700型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；DSC1型差示掃描量熱儀（瑞士Mettler Toledo公司）；1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；WD-2102A型酶標儀（北京六一儀器廠）；HERAcell 240i型CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；CKX41SF型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

白樺脂酸原料藥（武漢遠城科技發(fā)展有限公司，批號：BEA201504211，純度：≥98.5%）；白樺脂酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111802-201402，純度：≥98.5%）；精氨酸（北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司，批號：151205，純度：>99.8%，進口分裝）；5-氟尿嘧啶（5-FU，美國Sigma-Aldrich公司，批號：151018，純度：≥99.0%）；胎牛血清、青霉素、鏈霉素和RPMI-1640培養(yǎng)基均購自上海博耀生物科技有限公司；甲醇為色譜純，水為純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 細胞

三陰性人乳腺癌細胞株MDA-MB-231（中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院）。

2 方法與結(jié)果

2.1 精氨白樺脂酸的制備

按等摩爾比精密稱取白樺脂酸原料藥2 283.50 mg、精氨酸871.00 mg，混合均勻，置于球磨機中研磨12 h，即可獲得精氨白樺脂酸。

2.2 白樺脂酸/精氨酸物理混合物的制備

精密稱取白樺脂酸原料藥913.40 mg、精氨酸348.40 mg，混合均勻，置于研缽中研磨30 s，混勻，即得白樺脂酸/精氨酸物理混合物。

2.3 精氨白樺脂酸的表征

2.3.1 粉末X射線衍射 測定條件：銅靶，電壓40 kV，電流40 mA，在3 °～40 °范圍內(nèi)記錄樣品白樺脂酸原料藥、精氨酸、白樺脂酸/精氨酸物理混合物和精氨白樺脂酸的粉末X射線衍射圖譜見圖1。

由圖1可見，白樺脂酸原料藥是晶態(tài)化合物，有尖銳的特征衍射峰；精氨酸也屬晶態(tài)化合物；白樺脂酸/精氨酸物理混合物的主要衍射峰包含有精氨酸和白樺脂酸的衍射峰，為2種成分衍射峰的物理疊加；精氨白樺脂酸為非晶態(tài)化合物，因而無明顯尖銳衍射峰，表現(xiàn)為彌散衍射峰，由此表明通過制備過程精氨酸與白樺脂酸形成了新的物相。

2.3.2 傅里葉變換紅外光譜分析 利用傅里葉變換紅外光譜儀測定，光譜范圍4 000～650 cm-1，分辨率4.0 cm-1，掃描次數(shù)8次，測定白樺脂酸原料藥、精氨酸、白樺脂酸/精氨酸物理混合物及精氨白樺脂酸的紅外光譜，光譜圖見圖2。

白樺脂酸具有羽扇豆烷型骨架，分子中存在特征的偕二甲基、C=C雙鍵及羧基，這些結(jié)構(gòu)在其紅外譜圖上均可得到確認。由圖2可見，1 387 cm-1和1 376 cm-1處的特征雙峰為C-4連接的偕二甲基的C—H面內(nèi)彎曲振動；2 940、2 868、1 684 cm-1為C=O伸縮振動；1 448、882 cm-1為C=C雙鍵的伸縮振動吸收和面外彎曲振動。精氨酸在紅外光譜圖上可見—NH3的彎曲振動（1 573 cm-1）和—COO—的對稱伸縮振動（1 404 cm-1），和白樺脂酸原料藥相比，白樺脂酸/精氨酸物理混合物的紅外光譜差別不大。精氨白樺脂酸的紅外光譜圖中C=O伸縮振動明顯減弱并向低波數(shù)移動。紅外光譜分析結(jié)果提示，成鹽反應(yīng)是通過白樺脂酸的羧基與精氨酸中氨基進行的。

2.3.3 差示掃描量熱分析 分別精密稱取白樺脂酸原料藥、精氨酸、白樺脂酸/精氨酸物理混合物及精氨白樺脂酸各5 mg，進行差示掃描量熱分析，掃描溫度范圍為30～330 ℃，升溫速率為10 ℃/min，差示掃描量熱分析圖見圖3。

由圖3可知，白樺脂酸熔點為309.4 ℃，精氨酸的熔點為219.0 ℃，白樺脂酸/精氨酸物理混合物中可見精氨酸的熔點峰，而精氨白樺脂酸未見明顯的熔點峰，與上述物質(zhì)均存在明顯差異，由此證實了新物相的生成。

2.3.4 紫外光譜分析 采用雙光束紫外分光光度儀，將白樺脂酸原料藥、精氨酸及精氨白樺脂酸樣品分別用甲醇稀釋制成20 μg/mL的溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)進行掃描。結(jié)果顯示，白樺脂酸原料藥、精氨白樺脂酸在210 nm波長處有最大吸收峰，據(jù)此確定檢測波長210 nm。

2.4 增溶作用分析

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（93 ∶ 7，V/V）；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測波長：210 nm；柱溫：30 ℃。該色譜條件下，白樺脂酸的出峰時間約為8.3 min，白樺脂酸對照品甲醇溶液色譜圖見圖4。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密稱取白樺脂酸對照品25 mg，置于25 mL量瓶中，用甲醇定容，制備成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的貯備液。進一步稀釋貯備液制成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL的系列溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標（c）、峰面積為縱坐標（A）進行回歸分析，得回歸方程為A=6.019 8c+1.193 8（r2=0.999 6），白樺脂酸檢測質(zhì)量濃度在0.005～1.0 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.3 精密度試驗 取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的白樺脂酸對照品溶液，重復(fù)進樣6次，考察儀器精密度，結(jié)果顯示，峰面積的RSD為0.23%（n=6）。另精密稱取白樺脂酸對照品12.50 mg，各6份，置于25 mL量瓶中，甲醇定容，制成0.5 mg/mL溶液，分別進樣測定，考察批間精密度。結(jié)果顯示，峰面積的RSD為0.43%（n=6）。

2.4.4 準確度試驗 精密稱取精氨白樺脂酸，分別加入適量白樺脂酸對照品，加甲醇溶解，制成低、中、高質(zhì)量濃度（0.05、0.4、0.8 mg/mL）的質(zhì)控樣品，進樣測定峰面積，計算方法回收率。結(jié)果顯示，平均回收率為99.2%（RSD為1.34%，n=9）。

2.4.5 溶解度測定 取適量白樺脂酸對照品和精氨白樺脂酸，分別制備水飽和溶液，用濾紙過濾，再經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。分別取白樺脂酸對照品、精氨白樺脂酸飽和水溶液進樣，以峰面積計算白樺脂酸含量。結(jié)果表明，白樺脂酸對照品水溶液在保留時間8.3 min附近的峰面積為零，表明白樺脂酸幾乎不溶于水，精氨白樺脂酸可溶于水，且其中白樺脂酸的溶解度為50.72 μg/mL（n=3），白樺脂酸、精氨白樺脂酸水溶液的高效液相色譜圖見圖5。

2.5 精氨白樺脂酸對MDA-MB-231細胞的影響

2.5.1 細胞培養(yǎng) 將MDA-MB-231細胞置于含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI- 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2的濕潤無菌環(huán)境下培養(yǎng)。

2.5.2 溶液的制備 取白樺脂酸原料藥、精氨白樺脂酸、5-FU，分別用少量二甲基亞楓（DMSO）溶解，再經(jīng)RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋制成終質(zhì)量濃度分別為15、30、60、120 μg/mL的系列溶液。

2.5.3 形態(tài)學觀察 取指數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，加入精氨白樺脂酸終質(zhì)量濃度為0（空白對照）、60、120 μg/mL的含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，以倒置相差顯微鏡觀察MDA-MB-231細胞的形態(tài)學變化。正常情況下（空白對照），MDA-MB-231細胞呈長梭形，貼壁生長。在60、120 μg/mL精氨白樺脂酸作用48 h后，細胞數(shù)目明顯減少，且細胞變圓、縮小、老化，核質(zhì)發(fā)散，并隨濃度的升高，凋亡明顯，不同質(zhì)量濃度精氨白樺脂酸對MDA- MB-231細胞形態(tài)學的影響見圖6。

2.5.4 細胞增殖試驗 采用MTT比色法[16]，取指數(shù)生長期細胞，棄去培養(yǎng)基，加0.25%胰酶1 mL消化，用磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）洗滌1次，然后加新制的含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基。按3 000～6 000個/孔將細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入0.2 mL培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔，空白對照只加0.2 mL無細胞培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)24 h。吸棄原培養(yǎng)液，各孔依次加入“2.5.2”項下系列濃度的溶液200 μL。干預(yù)48 h后，用MTT法經(jīng)酶標儀在490 nm波長處測定光密度（OD），取平均值。計算細胞增殖抑制率，增殖抑制率（%）=（1-OD加藥/OD空白對照）×100%。t檢驗結(jié)果表明，與白樺脂酸原料藥比較，精氨白樺脂酸和5-FU對MDA-MB-231細胞的增殖抑制率明顯升高（P<0.05），且精氨白樺脂酸30 μg/mL以上其作用與5-FU比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。白樺脂酸原料藥、精氨白樺脂酸和5-FU對MDA-MB-231細胞增殖的影響見表1。

3 討論

機械化學是通過機械外力進行的固態(tài)反應(yīng)，屬于綠色化學中的一種。與傳統(tǒng)溶液法相比，機械化學法不引入溶劑（或者微量），且具有省時節(jié)能、選擇性好、產(chǎn)率高、條件溫和等特點。

白樺脂酸對正常組織具有低毒性的特點，由于其能克服腫瘤細胞一些特定形式的抵抗，與傳統(tǒng)的化療藥物相比，長期治療不易出現(xiàn)耐藥性，具有廣闊的開發(fā)前景，但是白樺脂酸的水溶性差，限制了其進一步的開發(fā)和利用，白樺脂酸不溶于水，通過考察其結(jié)構(gòu)特點發(fā)現(xiàn)，白樺脂酸在分子結(jié)構(gòu)中含有性質(zhì)活潑的酸性基團羧基，而精氨酸屬于堿性氨基酸，分子結(jié)構(gòu)中含有活潑的堿性氨基，利用機械化學的方法，可以利用酸堿反應(yīng)制備精氨酸白樺脂酸的鹽，借助精氨酸易溶于水的特性，作為載體，提高白樺脂酸的水溶性。筆者前期研究采用研磨法制備了精氨白樺脂酸，考察了不同時間點的制備效果，結(jié)果表明，當研磨時間為12 h時制備得精氨白樺脂酸，白樺脂酸通過與精氨酸成鹽，精氨白樺脂酸的溶解度達到50.72 μg/mL，由此拓寬了白樺脂酸進一步開發(fā)利用的領(lǐng)域。

白樺脂酸的最初報道主要是對黑素瘤具有專一的細胞毒性[17]，但最近研究[12-14]發(fā)現(xiàn)， 白樺脂酸對許多其他癌細胞都具有較為廣譜的生物活性。乳腺癌為女性常見的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率和高死亡率的特點。有研究[13]發(fā)現(xiàn)白樺脂酸對乳腺癌細胞MCF-7具有抑制作用，但其對MDA-MB-231細胞的抑制作用尚未見報道，MDA- MB-231細胞屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細胞系，容易成瘤，常用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究，而大多數(shù)乳腺癌患者死于轉(zhuǎn)移癌，因此筆者考察了白樺脂酸與精氨白樺脂酸對MDA-MB-231細胞的增殖抑制作用。結(jié)果表明，白樺脂酸通過與精氨酸成鹽生成精氨白樺脂酸，其對MDA- MB-231細胞的增殖抑制作用比白樺脂酸明顯提高，本試驗結(jié)果為白樺脂酸的進一步開發(fā)成為高效低毒的抗癌新藥提供了參考。

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（收稿日期：2017-09-12 修回日期：2017-10-31）

（編輯：鄒麗娟）