李建忠 張舸
【摘要】采用免疫親和層析凈化液相色譜法測定多種谷物(小麥、玉米和大米)樣品中的赭曲霉毒素A。提取液提取試樣中的赭曲霉毒素A,經(jīng)免疫親和柱凈化后,采用高效液相色譜法熒光檢測器測定,外標法定量。結果表明,不同糧食中赭曲霉毒素A在0.5~50.0ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系,相關系數(shù)(r)>0.999;樣品在0.3μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg三個添加水平下的加回收率為84.4%~96.7%;方法檢出限為0.3μg/kg,重復性的相對標準偏差為1.03%~3.17%。
【關鍵詞】免疫親和;層析凈化;液相色譜法;赭曲霉毒素A
赭曲霉毒素包括A、B、C、D四種結構類似的化合物,其中以赭曲霉毒素A(OTA)毒性最強、分布最廣、對人類和動物影響最大,廣泛分布于谷物、飼料及動物體內(nèi),對食品污染的范圍廣泛。毒理學研究表明,赭曲霉毒素A具有很強的肝臟毒性和腎臟毒性,并有致畸、致突變和致癌作用,許多國家對其制定了嚴格的限量標準,國際癌癥研究機構將其定為2B類致癌物,所以控制谷物中OTA的含量至關重要。國家標準GB 2761規(guī)定谷物及其研磨加工品中OTA限量為5.0μg/kg。采用國標方法GB5009.96-2016中免疫親和層析凈化液相色譜法,通過加標實驗測定陰性樣品中OTA含量,采用的方法和所得數(shù)據(jù)為糧油質(zhì)檢部門提供參考。
1材料與方法
1.1材料
新收獲玉米樣品,經(jīng)國標方法檢測后確定為陰性樣品。錘式旋風磨粉碎,85%過孔徑為1mm試驗篩,制備成玉米粉樣品。
1.2主要儀器與試劑
LC-2010AHT液相色譜儀,配熒光檢測器,日本島津公司;HQBTWT93不銹鋼均質(zhì)器,北京中檢維康生物技術有限公司;N-EVAPl2氮吹儀;CP512百分之一電子天平,上海奧豪斯儀器有限公司;OTA標準物質(zhì),濃度均為50.0μg/mL,有國家標準物質(zhì)證書;甲醇、乙腈、冰乙酸:色譜純;10倍PBS濃縮液;水為GB/T6682規(guī)定的一級水。
1.3高效液相色譜條件
熒光檢測器;C18柱色譜柱150mm×4.6mm×5μm;檢測波長:激發(fā)波長333nm,發(fā)射波長460nm;流動相:乙腈一水一冰乙酸(96+102+2、),流動相分別用抽濾器抽濾;流速:1.0mL/min;柱溫:35℃;進樣量:50μL。
1.4試劑制備
標準工作液:標準品原液用流動相稀釋成OTA濃度為500ng/mL,再用流動相分別稀釋成OTA濃度為0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的標準工作液;提取液制備:80份甲醇加20份水;PBS緩沖液制備:PBS濃縮液用水稀釋10倍。
1.5試樣制備、提取、凈化及檢測
(1)精確稱取樣品25.0g,加入提取液100mL,高速均質(zhì)2min后,槽紋濾紙過濾,準確取10mL濾液,用PBS緩沖液稀釋至50mL,混勻后,經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾,收集濾液備用。樣液不澄清再過濾一次。
(2)試樣凈化:連接OTA免疫親和柱在玻璃注射器下,準確移取20mL濾液,置于其中。調(diào)節(jié)空氣壓力泵壓力,以約1滴/s的流速使緩慢溶液通過免疫親和柱,直至空氣通過,依次以2滴/s的流速,用10mLPBS緩沖液、10mL水淋洗親和柱,至空氣通過,棄去流出液。
(3)洗脫:準確加入1.5mL甲醇洗脫液,以1滴/s的流速緩慢進行洗脫,用干凈的離心管收集全部洗脫液,在45℃下氮氣吹干,流動相復容到500μL,經(jīng)有機相針式過濾器后,取50μL進樣測定。同時做空白試驗。
1.6標準曲線的制作
將標準工作溶液由低到高濃度依次取50μL進樣測定重復4次,以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標,得到標準曲線線性方程。
1.7加標回收率測定
按照GB/T27404-2008附錄F的要求,回收率選擇赭曲霉毒素A濃度為0.3μg/kg.5.0μg/kg、10.0μg/kg三個水平進行測定。實驗分三組按照1.5的步驟進行測定,每組樣品數(shù)為8份,加OTA標液濃度為500ng/mL。
1.8重復性測定
分別用濃度為0.5ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL的標準溶液,進行重復8次的測定,用測得的峰面積,分別計算相對標準偏差RSD值。
2結果與分析
(1)赭曲霉毒素A標準液線性方程及線性相關系數(shù)測定結果見表1,結果表明:該色譜條件下,赭曲霉毒素A出峰時間為7.56min,在0.5~50.0ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關系,相關系數(shù)(r)>0.999,該方法的檢出限為0.3μg/kg。
(2)加標回收率測定結果見表2,在0.3μg/kg水平下,回收率在84.4%~87.4%之間;在5.0μg/kg水平下,回收率在91.2%~96.7%之間;在10.0μg/kg水平下,回收率在97.4%~99.3%之間。結果表明:樣品在0.3μg/kg.5.0μg/kg和10.0μg/kg三個添加水平下的加標回收率為84.4%~96.7%,符和GB/T 27404-2008附錄F的規(guī)定。
(3)重復性測定結果見表3,結果表明:三個濃度下8次重復測定的相對標準偏差RSD值為1.03%~3.17%,濃度越高重復性越好。符合GB/T 27404-2008附錄F的規(guī)定。
3結論
免疫親和層析凈化液相色譜法,操作簡便、快速準確、回收率高、精密度良好、重現(xiàn)性好,適合谷物中赭曲霉毒素A的檢測。