李建忠 張舸

【摘要】采用免疫親和層析凈化液相色譜法測(cè)定多種谷物（小麥、玉米和大米）樣品中的赭曲霉毒素A。提取液提取試樣中的赭曲霉毒素A，經(jīng)免疫親和柱凈化后，采用高效液相色譜法熒光檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，不同糧食中赭曲霉毒素A在0.5～50.0ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）>0.999；樣品在0.3μg/kg、5.0μg/kg和10.0μg/kg三個(gè)添加水平下的加回收率為84.4%～96.7%；方法檢出限為0.3μg/kg，重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%～3.17%。

【關(guān)鍵詞】免疫親和；層析凈化；液相色譜法；赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素包括A、B、C、D四種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中以赭曲霉毒素A（OTA）毒性最強(qiáng)、分布最廣、對(duì)人類和動(dòng)物影響最大，廣泛分布于谷物、飼料及動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)食品污染的范圍廣泛。毒理學(xué)研究表明，赭曲霉毒素A具有很強(qiáng)的肝臟毒性和腎臟毒性，并有致畸、致突變和致癌作用，許多國家對(duì)其制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其定為2B類致癌物，所以控制谷物中OTA的含量至關(guān)重要。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761規(guī)定谷物及其研磨加工品中OTA限量為5.0μg/kg。采用國標(biāo)方法GB5009.96-2016中免疫親和層析凈化液相色譜法，通過加標(biāo)實(shí)驗(yàn)測(cè)定陰性樣品中OTA含量，采用的方法和所得數(shù)據(jù)為糧油質(zhì)檢部門提供參考。

1材料與方法

1.1材料

新收獲玉米樣品，經(jīng)國標(biāo)方法檢測(cè)后確定為陰性樣品。錘式旋風(fēng)磨粉碎，85%過孔徑為1mm試驗(yàn)篩，制備成玉米粉樣品。

1.2主要儀器與試劑

LC-2010AHT液相色譜儀，配熒光檢測(cè)器，日本島津公司；HQBTWT93不銹鋼均質(zhì)器，北京中檢維康生物技術(shù)有限公司；N-EVAPl2氮吹儀；CP512百分之一電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；OTA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，濃度均為50.0μg/mL，有國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書；甲醇、乙腈、冰乙酸：色譜純；10倍PBS濃縮液；水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

1.3高效液相色譜條件

熒光檢測(cè)器；C18柱色譜柱150mm×4.6mm×5μm；檢測(cè)波長：激發(fā)波長333nm，發(fā)射波長460nm；流動(dòng)相：乙腈一水一冰乙酸（96+102+2、），流動(dòng)相分別用抽濾器抽濾；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：50μL。

1.4試劑制備

標(biāo)準(zhǔn)工作液：標(biāo)準(zhǔn)品原液用流動(dòng)相稀釋成OTA濃度為500ng/mL，再用流動(dòng)相分別稀釋成OTA濃度為0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液；提取液制備：80份甲醇加20份水；PBS緩沖液制備：PBS濃縮液用水稀釋10倍。

1.5試樣制備、提取、凈化及檢測(cè)

（1）精確稱取樣品25.0g，加入提取液100mL，高速均質(zhì)2min后，槽紋濾紙過濾，準(zhǔn)確取10mL濾液，用PBS緩沖液稀釋至50mL，混勻后，經(jīng)玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液備用。樣液不澄清再過濾一次。

（2）試樣凈化：連接OTA免疫親和柱在玻璃注射器下，準(zhǔn)確移取20mL濾液，置于其中。調(diào)節(jié)空氣壓力泵壓力，以約1滴/s的流速使緩慢溶液通過免疫親和柱，直至空氣通過，依次以2滴/s的流速，用10mLPBS緩沖液、10mL水淋洗親和柱，至空氣通過，棄去流出液。

（3）洗脫：準(zhǔn)確加入1.5mL甲醇洗脫液，以1滴/s的流速緩慢進(jìn)行洗脫，用干凈的離心管收集全部洗脫液，在45℃下氮?dú)獯蹈桑鲃?dòng)相復(fù)容到500μL，經(jīng)有機(jī)相針式過濾器后，取50μL進(jìn)樣測(cè)定。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將標(biāo)準(zhǔn)工作溶液由低到高濃度依次取50μL進(jìn)樣測(cè)定重復(fù)4次，以峰面積為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。

1.7加標(biāo)回收率測(cè)定

按照GB/T27404-2008附錄F的要求，回收率選擇赭曲霉毒素A濃度為0.3μg/kg.5.0μg/kg、10.0μg/kg三個(gè)水平進(jìn)行測(cè)定。實(shí)驗(yàn)分三組按照1.5的步驟進(jìn)行測(cè)定，每組樣品數(shù)為8份，加OTA標(biāo)液濃度為500ng/mL。

1.8重復(fù)性測(cè)定

分別用濃度為0.5ng/mL、5.0ng/mL、20.0ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行重復(fù)8次的測(cè)定，用測(cè)得的峰面積，分別計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

2結(jié)果與分析

（1）赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)液線性方程及線性相關(guān)系數(shù)測(cè)定結(jié)果見表1，結(jié)果表明：該色譜條件下，赭曲霉毒素A出峰時(shí)間為7.56min，在0.5～50.0ng/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）>0.999，該方法的檢出限為0.3μg/kg。

（2）加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果見表2，在0.3μg/kg水平下，回收率在84.4%～87.4%之間；在5.0μg/kg水平下，回收率在91.2%～96.7%之間；在10.0μg/kg水平下，回收率在97.4%～99.3%之間。結(jié)果表明：樣品在0.3μg/kg.5.0μg/kg和10.0μg/kg三個(gè)添加水平下的加標(biāo)回收率為84.4%～96.7%，符和GB/T 27404-2008附錄F的規(guī)定。

（3）重復(fù)性測(cè)定結(jié)果見表3，結(jié)果表明：三個(gè)濃度下8次重復(fù)測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值為1.03%～3.17%，濃度越高重復(fù)性越好。符合GB/T 27404-2008附錄F的規(guī)定。

3結(jié)論

免疫親和層析凈化液相色譜法，操作簡便、快速準(zhǔn)確、回收率高、精密度良好、重現(xiàn)性好，適合谷物中赭曲霉毒素A的檢測(cè)。