林 鷙,何錫忠,李本強,潘 潔,朱永軍,趙本進,彭麗英

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海201106)

豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)是由豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的急性傳染病,臨床特征為動物發(fā)熱、奇癢及繁殖障礙等。目前,該病尚無有效的治療藥物,疫苗免疫是預(yù)防該病的主要途徑。2011年以來,一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國爆發(fā),主要造成母豬繁殖障礙和初生乳豬死亡[1-3]。而接種傳統(tǒng)的偽狂犬病疫苗已不能完全保護偽狂犬病毒變異毒株的侵襲。

PRV gE基因全長1 740 bp,其N端包含機體免疫系統(tǒng)能識別的主要靶抗原。gE是PRV復(fù)制的非必需基因,已經(jīng)有研究表明,gE的缺失能降低病毒的嗜神經(jīng)性且不影響其免疫原性[4]。

目前,針對病毒基因改造主要是通過同源重組、細(xì)菌人工染色體等技術(shù)來進行的。CRISPR∕Cas9是最新出現(xiàn)的一種由RNA指導(dǎo)的Cas9核酸酶對靶向基因進行編輯的技術(shù),Cas9蛋白在序列靶定位點切斷雙鏈DNA,然后再通過非同源重組末端連接和同源重組的方式對斷鏈DNA進行修復(fù)。已有研究表明,CRISPER∕Cas9系統(tǒng)能夠編輯人皰疹病毒的基因組[5]。

本試驗通過構(gòu)建針對PRV gE基因的Cas9∕gRNA載體,對實驗室分離得到的變異毒株P(guān)RV-SX株進行編輯,并通過蝕斑純化方法篩選得到突變毒株并對突變毒株的免疫效果進行研究,以期為后續(xù)的基因缺失滅活疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種毒、細(xì)胞

豬偽狂犬病毒PRV-SX株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所分離所得。ST細(xì)胞由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所保存。

1.1.2 試驗試劑及耗材

豬偽狂犬病毒gB和gE抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司。胎牛血清、胰酶和DMEN為Invitrogen公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自上海生工生物科技有限公司。病毒基因組DNA∕RNA提取試劑盒(DP315)購自天根生化科技(北京)有限公司。Cas9∕gRNA構(gòu)建試劑盒(VK001-02)、gRNA靶點效率試劑盒(VK007)、T7E1核酸酶均購自北京唯尚立德生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1gE基因Cas9∕gRNAs載體的構(gòu)建

利用在線gRNA設(shè)計網(wǎng)站(http：∕∕crispr.mit.edu∕)設(shè)計4對針對PRV gE基因的gRNAs。利用商品化的CRISPR∕Cas9構(gòu)建試劑盒構(gòu)建同時表達Cas9和gRNA的Cas9∕gRNA載體。

1.2.2 病毒基因組的提取

取200 μL病毒懸液于1.5 mL離心管中,反復(fù)凍融3次,按照病毒基因組DNA∕RNA提取試劑盒(DP315)說明書提取病毒DNA。

1.2.3 T7E1酶切試驗

設(shè)計1對能擴增出帶有突變位點的DNA片段(F：CACCATCGCAGAGGAACAATA;R：TTGTGGGTCATCACGAGCAC),將擴增得到的野生型和突變型PCR產(chǎn)物混合后進行加熱沸騰使其變性,自然冷卻至室溫復(fù)性,復(fù)性完成后加入0.5 μL T7E1酶,混勻后37℃反應(yīng)30 min,65℃滅活,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 測序分析

將得到的PCR產(chǎn)物膠回收后,送上海生工生物工程有限公司測序,測序結(jié)果與野生型PRV gE基因比對,明確PRV gE基因中的突變位置和突變類型。

1.2.5 偽狂犬病滅活疫苗制備

將PRV gE基因缺失毒株接種ST細(xì)胞,細(xì)胞病變達90%時收獲,測得TCID50∕mL達108.0,經(jīng)甲醛滅活后與206佐劑按1∶1的比例配制,保存于2—8℃冰箱中待用。

1.2.6 動物免疫試驗

于南京某豬場購10頭21日齡的PRV抗體陰性的三元豬仔豬。將仔豬隨機分成2組,第一組接種偽狂犬病滅活疫苗,每頭2 mL;第二組每頭接種2 mL PBS溶液作為對照。免疫28 d后加強免疫1次,分別采取免疫后0 d、14 d、28 d、42 d、56 d的血清,檢測血清中g(shù)B和gE抗體水平。

圖1 Cas9∕gRNA的活性檢測Fig.1 Activity detection of Cas9∕gRNA

2 結(jié)果與分析

2.1 Cas9∕gRNAs-gE 載體構(gòu)建

對合成好的Cas9∕gRNA進行活性檢測,與標(biāo)準(zhǔn)品1和標(biāo)準(zhǔn)品2進行對比,結(jié)果顯示(圖1)：gRNA1的酶切效率為50%(第1泳道),gRNA2酶切效率為80%(第2泳道),gRNA3酶切效率為60%(第3泳道),gRNA4酶切效率為95%(第4泳道)。選用活性較高的gRNA靶點(gRNA2和gRNA4)進行后續(xù)細(xì)胞試驗。

2.2 突變毒株的純化

T7E1核酸酶能夠識別錯配的雜合雙鏈并進行剪切。為了得到突變的毒株,轉(zhuǎn)染構(gòu)建好的Cas9∕gRNAs-gE入ST細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后接種PRV,待細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)時收集上清及細(xì)胞,提取病毒DNA,如圖2第3泳道結(jié)果所示,PCR擴增出帶有突變位點DNA片段,長度1 204 bp,退火經(jīng)T7E1酶切后出現(xiàn)800 bp和400 bp的兩條突變型條帶,說明該毒株含有突變。在此基礎(chǔ)上進行蝕斑純化,篩選得到純的突變毒株,如圖3中第3泳道和第4泳道所示,T7E1酶切鑒定得到純的突變毒株。以上結(jié)果表明,應(yīng)用CRISPER∕Cas9編輯得到了突變毒株。

圖2 T7E1酶切鑒定突變毒株Fig.2 Identification of mutant strains by T7E1 enzyme digestion

圖3 T7E1酶切鑒定純化后的突變毒株Fig.3 Identification of purified mutant strains by T7E1 enzyme digestion

圖4 測序結(jié)果Fig.4 Sequencing results

2.3 測序分析

為驗證突變的具體位置及突變類型,對純化后的突變毒株的PCR產(chǎn)物進行測序。結(jié)果顯示得到了1株突變毒株,在設(shè)計位點上缺失了AG兩個堿基,從而造成了閱讀框的移碼突變(圖4)。

2.4 動物免疫試驗

PRV gB抗體檢測結(jié)果顯示(圖5A)：免疫組免疫14 d后gB抗體均呈陽性,并在免疫42 d后達到強陽性,S∕N值小于0.05且離散度小;對照組gB抗體均為陰性。全部試驗豬PRV gE抗體在整個試驗過程均呈陰性(圖5B)。

圖5 免疫豬PRV特異性抗體變化Fig.5 PRV specific antibody responses in piglets

3 討論

近年來,一種由偽狂犬病毒變異毒株引起的豬偽狂犬病在我國爆發(fā),給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。國內(nèi)許多學(xué)者對新流行的PRV毒株的基因特征、免疫原性等進行了一系列的研究,并且開展了疫苗的研制工作。Wang等[6]通過同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV TJ株的gE缺失突變株,6周齡的仔豬免疫該毒株后可以完全抵擋TJ株的致死性攻擊。Gu等[7]利用細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC),Tong等[8]利用同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV gI∕gE雙缺失突變毒株,后續(xù)動物實驗表明以該毒株制備的疫苗具有良好的免疫保護效果。此外,也有學(xué)者分別通過細(xì)菌人工染色體技術(shù)(BAC)、同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV TK∕gI∕gE三缺失突變株,也評價了該毒株對仔豬的免疫保護效果[9-11]。同源重組是一種經(jīng)典的編輯手段,但是存在重組概率低,操作復(fù)雜等難題,因此本研究通過設(shè)計針對PRV gE基因的gRNA,利用CRISPR∕Cas9編輯系統(tǒng)成功編輯了PRV gE基因,利用蝕斑純化得到了一株gE基因缺失的突變毒株,T7E1核酸酶酶切鑒定正確,測序發(fā)現(xiàn)在設(shè)計位點上缺失了CT兩個堿基,造成了閱讀框的移碼突變。隨后將該毒株制成疫苗免疫了21日齡的仔豬,監(jiān)測免疫后不同時間點的PRVgE和gB糖蛋白的特異性抗體,結(jié)果顯示該毒株免疫效果很好。這些數(shù)據(jù)表明通過CRISPR∕Cas9系統(tǒng)構(gòu)建的基因缺失突變毒株的免疫效果與其他科學(xué)家通過傳統(tǒng)方法構(gòu)建的突變毒株免疫效果相當(dāng)。

本研究表明,運用特定的gRNA,CRISPR∕Cas9系統(tǒng)能夠編輯PRV基因組,通過缺失堿基最終導(dǎo)致基因的移碼突變,由此可見對于難以操作的大型DNA病毒來說,CRISPR∕Cas9系統(tǒng)是一個重要的編輯工具。此外,本研究構(gòu)建的gE基因缺失毒株具有良好的免疫原性且免疫后不產(chǎn)生針對gE糖蛋白的抗體,可以用來區(qū)分疫苗免疫動物和野毒感染動物。因此,該毒株可作為PRV疫苗候選毒株用于防控PRV。