王云龍 徐瑞芳 李玉林 王繼創(chuàng) 程春杰 高玉紅

（1. 鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450001；2. 河南省生物工程技術(shù)研究中心，鄭州 450001；3. 生物標(biāo)志物定量檢測河南省工程實驗室，鄭州 450001）

人體中胱抑素C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一個類型［1］，研究表明，人體血液及尿液中胱抑素C含量幾乎不受飲食的影響，但當(dāng)腎小球過濾功能減退時，胱抑素C在血中的含量升高［2］。血清（漿）胱抑素C水平測定，可反映出腎小球濾過功能的狀況，將其作為臨床檢測指標(biāo)優(yōu)于血清（漿）尿素、肌酸、肌酐和Ccr等測定方法［3-6］，檢測胱抑素C可靈敏的反映腎小球的濾過功能，在評價由糖尿病、急性腎功能衰竭、高血壓、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等原因引起的早期腎損害方面起著重要的作用，可替代血清肌酐評估急性腎功能衰竭（ARF）、兒童腎病患者的GFR檢測標(biāo)志物、在腎移植中急、慢性排斥反應(yīng)及免疫抑制藥物的毒性觀察指標(biāo)、腫瘤向外浸潤和轉(zhuǎn)移及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的腎臟受累［7-12］。

胱抑素C的臨床檢測主要采用免疫學(xué)方法［13］，包括熒光免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、顆粒增強(qiáng)透射免疫比濁法［14］。這些方法均利用了胱抑素C和其抗體特異性反應(yīng)的原理，其建立的基礎(chǔ)是獲得質(zhì)量較高的胱抑素C配對抗體，檢測試劑的質(zhì)量與抗體質(zhì)量密切相關(guān)［15-16］。因此，本研究通過制備針對胱抑素C不同區(qū)域抗原決定簇的配對抗體，建立更加特異和靈敏的胱抑素C檢測技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 MES、碳二亞胺（EDC），上海生工生物工程有限公司；牛血清白蛋白（BSA），天津正江現(xiàn)代生物技術(shù)公司；弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA），Sigma公司；HT、HAT，Gibco；小鼠IgG、ELISA檢測用試劑、化學(xué)發(fā)光檢測用試劑，河南省生物工程技術(shù)研究中心；胱抑素C高值血清，由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。

1.1.2 儀器設(shè)備 搖床，SHIPING，SHP-100B；離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司，H1850R；酶標(biāo)儀，MK 3，Thermo；pH計，雷磁，PHS-3E；化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，廈門天眾達(dá)生物科技有限公司，ECLIA-ⅡS；超微量蛋白檢測儀，北京凱奧科技有限公司，K 5500；超凈工作臺，吳江市金曉空調(diào)凈化有限公司，SW-CJ-1F；CO2培養(yǎng)箱，Thermo，BB150；倒置顯微鏡，奧特光學(xué)，BDS400。

1.1.3 實驗動物 6-8周齡的健康雌性小鼠由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 免疫原制備 （1）免疫原設(shè)計：根據(jù)GenBank中NM＿000099. 2序列所編碼的胱抑素C蛋白采用DNAS2.0分析蛋白的抗原表位，篩選出以下5段優(yōu)勢表位多肽進(jìn)行人工合成。C1：1-15 aa；C2：37-49 aa；C3：56-61 aa；C4：85-91 aa；C5：108-110 aa。多肽由上海生工合成。

（2）多肽偶聯(lián)：用 MES緩沖液（0.1 mol/L，pH 6.5）將Cys C多肽配制成終濃度為10 mg/mL的溶液，將EDC活化劑配制成10 mg/mL。取配制好的5種Cys C多肽各1 mg、鼠IgG 4 mg、EDC 3 mg于1.5 mL離心管中，混合均勻，放入25℃搖床中，震蕩偶聯(lián)12 h。然后用0.02 mol/L pH7.4的磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline，PBS）作為透析液進(jìn)行透析做免疫小鼠用。取配制好的5種Cys C多肽各1 mg、BSA 4 mg、EDC 3 mg于1.5 mL離心管中，混合均勻，放入25℃搖床中，震蕩偶聯(lián)12 h。用0.02 mol/L pH7.4的PBS作為透析液進(jìn)行透析做檢測抗原用。

1.2.2 抗原免疫 將C1、C2、C3、C4、C5五種多肽的鼠IgG偶聯(lián)物分別加入佐劑進(jìn)行免疫。取15只出生后6-8周的健康雌性小鼠，3只一組共5組，采用腹腔注射方式按照表1的免疫方法進(jìn)行免疫。二免結(jié)束時，取小鼠尾血制備血清，使用間接ELISA法測定其抗體效價，三免疫結(jié)束時同樣獲得血清測定，若其中的抗體效價高于1∶104結(jié)束免疫。

1.2.3 雜交瘤制備及篩選 按常規(guī)操作制備雜交瘤［17-18］。采用相應(yīng)的BSA偶聯(lián)多肽作為包被，包被濃度為200 ng/孔，羊抗鼠IgG酶標(biāo)濃度1∶2 000。

表1 小鼠免疫方法

采用ELISA競爭法對融合細(xì)胞上清進(jìn)行測定。（1）包被板制備：用包被液分別將5種BSA偶聯(lián)多肽稀釋至 2 μg/mL，100 μL/孔 4℃過夜包被，包被結(jié)束后棄包被液，用洗液洗板1次，在不脫落纖維的布上拍干。加入封閉液150 μL/孔，37℃封閉2 h，4℃干燥存放。（2）競爭法檢測：分別加入稀釋后的融合細(xì)胞上清100 μL/孔、稀釋后的融合細(xì)胞上清和含0.6 μg/mL胱抑素C的血清各50 μL、稀釋后的融合細(xì)胞上清和含15.3 μg/mL胱抑素C的血清各50 μL，加入對照，做好標(biāo)記，粘貼封板膜，37℃孵育30 min。棄上清，洗板5次拍干，每孔加100 μL用酶標(biāo)稀釋液1：2 000稀釋的兔抗鼠-IgG酶標(biāo)抗體，粘貼封板膜，37℃孵育30 min。棄上清洗板5次拍干，每孔分別加入底物A液50 μL、底物B液50 μL，用微型振蕩器震蕩混合均勻孔內(nèi)液體，粘貼封板膜、37℃孵育20 min。每孔加入終止液50 μL終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在450 nm、630 nm雙波長下檢測結(jié)果。

1.2.4 抗體制備及配對篩選 用常規(guī)方法制備腹水［17-18］，采用辛酸硫酸銨沉淀法對抗體進(jìn)行純化，用經(jīng)典過碘酸鈉對抗體進(jìn)行標(biāo)記后稀釋調(diào)整為終濃度2 mg/mL。

從醫(yī)院取得胱抑素C高值血清，用博奧賽斯（天津）生物科技有限公司生產(chǎn)的胱抑素C（CysC）定量檢測試劑盒（化學(xué)發(fā)光法），反復(fù)進(jìn)行標(biāo)定，制備胱抑素C含量為20 000 ng/mL的高值室內(nèi)參考品，用5%BSA稀釋制備出一套胱抑素C線性參考品（50-20 000 ng/mL）。

挑取10株競爭抑制效果佳的單抗，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫檢測方法對各個單克隆抗體和HRP標(biāo)記抗體進(jìn)行配對篩選?？贵w包被量為200 ng/孔，4℃過夜包被，采用5%BSA進(jìn)行封閉，37℃封閉2 h。HRP標(biāo)記抗體稀釋倍數(shù)為1∶20 000，利用制備的胱抑素C質(zhì)控品（P8 10 000 ng/mL）進(jìn)行初步篩選。

據(jù)初篩結(jié)果對發(fā)生陽性反應(yīng)的單克隆抗體進(jìn)一步進(jìn)行篩選。每組配對組合的抗體包被量、標(biāo)記量、反應(yīng)模式與抗體配對初篩一致，樣本采用胱抑素C質(zhì)控品P8 10 000 ng/mL、P4 500 ng/mL，并保留一孔空白對照，空白對照為等量的樣品稀釋液（表2）。

表2 配對抗體篩選

1.2.5 配對抗體親和常數(shù)的測定 用間接ELISA法測定抗體親和反應(yīng)曲線，取Cys-C抗原按每孔400、200、100、50 ng 包被酶標(biāo)板，將1B7、5H3單抗每株做倍比稀釋加入酶標(biāo)孔，做間接 ELISA，測定每孔OD值。以抗體濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，每種抗體得出4條反應(yīng)曲線，以每條曲線上部趨于平坦段的OD值作為 100%，在曲線上查出50% OD值相對應(yīng)的抗體濃度［19-21］。代入 Ka=（n-1）/2（n［Ab′］t-［Ab］t），計算單克隆抗體的親和常數(shù)Ka。［Ab′］t、［Ab］t 表示抗原濃度為［Ag′］t和［Ag］t時 50%OD對應(yīng)的抗體濃度；n為抗原濃度［Ag′］t和［Ag］t 間的稀釋倍數(shù)。

1.2.6 化學(xué)發(fā)光檢測體系建立 將篩選出的胱抑素C配對包被抗體和HRP酶標(biāo)記抗體，通過棋盤滴定實驗，確定最佳抗體包被量和酶標(biāo)抗體稀釋倍數(shù)，建立化學(xué)發(fā)光檢測體系。

用包被緩沖液將胱抑素C抗體稀釋至2 μg/mL，按100 μL/孔加入微孔板中，4℃包被過夜。除去孔內(nèi)液體，洗板一次拍干，按150 μL/孔加入封閉液，37℃封閉2 h，去除孔內(nèi)液體，拍板后烘干。加入100 μL線性參考品，37℃溫浴30 min，去除孔內(nèi)液體，洗板5次拍干。將酶標(biāo)抗體1∶5 000稀釋后100 μL/孔加樣，37℃反應(yīng)30 min，洗板5次拍干。每孔分別加入發(fā)光底物A液50 μL，發(fā)光底物B液50 μL，用微型振蕩器震蕩，使孔內(nèi)液體混合均勻，避光反應(yīng)5 min，立即放入化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測，分析實驗結(jié)果。

1.2.7 化學(xué)發(fā)光法分析性能檢測

（1）線性范圍和最低檢測限：采用挑選好的配對抗體按建立的化學(xué)發(fā)光檢測體系檢測自制參考品，用Log（X）-Logit（Y）數(shù)學(xué)模型進(jìn)行線性回歸處理。

用5%BSA作為零濃度校準(zhǔn)品檢測，重復(fù)測定10次，得出10次測量結(jié)果，計算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD，根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合得出一次方程，將M+2SD的結(jié)果代入上述方程中，求出對應(yīng)的濃度值，即為最低檢測限。

（2）精密度：用自制的化學(xué)發(fā)光檢測方法檢測15 000 ng/mL、1 000 ng/mL、100 ng/mL的胱抑素C參考品各10孔，計算變異系數(shù)（CV%），為批內(nèi)精密性。用不同批次包被板重復(fù)3次實驗，計算各濃度檢測30次的變異系數(shù)（CV%），為批間精密性。

（3）準(zhǔn)確度：采用回收率確定準(zhǔn)確度，將高值胱抑素C血清（20 000 ng/mL）用5%BSA稀釋獲得理論濃度為15 000、1 000、100 ng/mL的樣品，檢測發(fā)光值，根據(jù)線性參考品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算實際濃度，回收率=實際濃度/理論濃度×100%。

（4）方法學(xué)比對：取50份臨床血清經(jīng)過乳膠免疫比濁法測定過的血清，用本研究建立的化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測。以自建系統(tǒng)檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)，以臨床檢測值為橫坐標(biāo)，建立相關(guān)線性分析。

2 結(jié)果

2.1 抗原免疫及雜交瘤制備

C1、C2、C3、C4、C5五種多肽的鼠IgG偶聯(lián)物免疫后獲得血清效果大于1∶104的小鼠分別制備雜交瘤，用競爭法篩選陽性融合細(xì)胞，共獲得可與天然胱抑素C蛋白反應(yīng)的單抗39株（表3）。

表3 胱抑素C多肽免疫小鼠及細(xì)胞融合檢測結(jié)果

2.2 腹水制備及抗體純化

腹水制備采用常規(guī)方法，抗體純化采用辛酸硫酸銨沉淀法，所純化抗體純度均高于95%。

2.3 抗體配對

按初篩結(jié)果選擇可發(fā)生陽性反應(yīng)的5對組合抗體進(jìn)行進(jìn)一步篩選?？贵w配對結(jié)果如表4，選擇P8/P4 比值最高者作為最優(yōu)抗體組合，即選擇1B7包被、5H3標(biāo)記作為后續(xù)建立檢測方法的配對抗體。

2.4 配對抗體親和常數(shù)檢測

對1B7和5H3雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗體進(jìn)行親和常數(shù)的測定，分別為3.2×1011M-1和4.3×1011M-1。抗體親和力高，適用于定量檢測試劑的研發(fā)。

2.5 化學(xué)發(fā)光法分析性能檢測

（1）線性范圍和最低檢測限：自建Cys C檢測系統(tǒng)線性范圍為50-20 000 ng/mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸為一程為Y=1.088X + 3.821 8（r=0.995 6）。5% BSA重復(fù)檢測10次，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，確定最低檢出限為 3 ng/mL。

表4 抗體配對篩選結(jié)果

（2）精密度：15 000 ng/mL血清批內(nèi)精密性為2.19%，批間精密性為3.23%；1000ng/mL血清檢測批內(nèi)精密性為4.84%，批間精密性為5.03%；100ng/mL血清檢測批內(nèi)精密性為6.83%，批間精密性為7.03%。

（3）回收率：檢測理論濃度為15 000 ng/mL、1 000 ng/mL、100 ng/mL的樣品，根據(jù)檢測結(jié)果計算實際濃度，如表5，回收率均在85%-115%范圍內(nèi)，符合化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒性能要求。

表5 回收率檢測

（4）方法學(xué)比對：用1B7包被、5H3標(biāo)記建立的化學(xué)發(fā)光檢測法與免疫比濁法對50份臨床樣本的檢測數(shù)據(jù)建立相關(guān)性曲線。如圖1所示，相關(guān)性方程為y=1.068 5x+0.051 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.985，兩者相關(guān)性良好。

3 討論

血清（漿）胱抑素C水平測定，是一種可反映腎小球濾過功能的較理想指標(biāo)，臨床上采用血清中胱抑素C的含量作為檢測早期腎損傷的指標(biāo)之一，臨床實驗室對胱抑素C的檢測主要采用免疫學(xué)方法進(jìn)行檢測，其中化學(xué)發(fā)光法以其線性范圍寬、靈敏度高成為免疫學(xué)檢測方法的一個重要發(fā)展方向。由于免疫學(xué)檢測方法針對的是抗原抗體反應(yīng)，所以抗體的質(zhì)量成為決定檢測試劑質(zhì)量的重要因素。

圖1 本方法與市售膠乳免疫比濁法檢測試劑盒對比結(jié)果

常規(guī)的單抗篩選采用包被抗原檢測，很多抗原為基因工程抗原或多肽，并不能完全等同于天然的胱抑素C蛋白，因此，篩選出來的抗體并不能保證可以和天然蛋白反應(yīng)。為解決這一問題，我們采用包被抗原，在檢測體系中加入胱抑素C定值人血清，采用競爭抑制法對抗體鑒定、對初步篩選的抗體配對、對其進(jìn)行了初步分析性能評估，建立了線性范圍為50-20 000 ng/mL、最低檢測限為3 ng/mL的化學(xué)發(fā)光胱抑素C檢測方法，比起現(xiàn)有試劑，50-20 000 ng/mL的檢測范圍更寬，靈敏度也更高。本研究為后續(xù)優(yōu)選出更適合化學(xué)發(fā)光法的配對抗體，為該類試劑質(zhì)量提升提供了核心物質(zhì)。

4 結(jié)論

本實驗以合成胱抑素C多肽為抗原免疫小鼠，采用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，以人胱抑素C天然血清為樣本通過酶聯(lián)免疫競爭抑制法篩選獲得胱抑素C單抗細(xì)胞39株。優(yōu)選出配對抗體建立了化學(xué)發(fā)光檢測胱抑素C的方法。