周錦禎，劉婷婷，陳鑒宇，郭偉鵬

（華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室；廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室；廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實驗室；廣東省微生物分析檢測中心；廣東省微生物研究所，廣東廣州 510070）

濾膜法廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、食品及飲料工業(yè)、 化妝品、制藥工業(yè)品質(zhì)控制中微生物的分析。其方法是將一定量樣品注入的微孔薄膜的濾中，經(jīng)過抽濾，細(xì)菌被截留在濾膜上，將濾膜貼于指定培養(yǎng)基上，在適宜的溫度環(huán)境下培養(yǎng)后，經(jīng)計數(shù)和鑒定濾膜上生長的菌落，依據(jù)過濾樣品體積計算樣品中的菌落數(shù)。濾膜法優(yōu)點較多，當(dāng)產(chǎn)品含有抑菌成分物質(zhì)時，采用濾膜法可以有效降低或去除抑菌成分，消除抑制作用，且可以保證標(biāo)準(zhǔn)要求的檢出限，提高樣品檢測靈敏度[1～3]。濾膜法較平板計數(shù)法雖成本高，但其優(yōu)點是不受體積限制，且操作簡便，快速，濃縮效應(yīng)使微生物檢測的準(zhǔn)確度提高，再現(xiàn)性好。主要適用于雜質(zhì)較少且含菌量少的可過濾樣品。藥品、水等微生物方面的檢驗均較多使用濾膜法，但由于食品的樣品特性和微生物限值導(dǎo)致使用濾膜法較少，食品微生物檢測方法主要使用平板計數(shù)法進(jìn)行微生物的定量檢測。但隨著食品微生物檢驗技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，濾膜法逐漸應(yīng)用于飲料原輔料，成品及半成品等微生物檢驗中，在飲料的質(zhì)量控制中，濾膜法適用于非混懸飲料成品及半成品的微生物檢驗[4]。針對可過濾飲料這種食品用濾膜法檢測微生物學(xué)指標(biāo)，本實驗用濾膜法與平板計數(shù)法測定可過濾飲料樣品中的微生物學(xué)指標(biāo)，包括：菌落總數(shù)測定、霉菌計數(shù)、酵母計數(shù)以及大腸菌群計數(shù)檢驗。參照采用ISO 17994-2014《水質(zhì)-用兩種定量方法對比微生物回收率的基本要求》對濾膜法和平板計數(shù)法的結(jié)果進(jìn)行比較分析，以驗證兩者在可過濾液體飲料微生物學(xué)檢驗過程中的可替代性及等效性，為推動濾膜法在微生物分析檢測中的應(yīng)用提供科學(xué)參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

枯草芽孢桿黑色變種Bacillus subtilis var. niger（ATCC 9372）、白色念珠菌canidia Albicans（ATCC 10231）、黑曲霉Aspergillus niger（ATCC 16404）、大腸桿菌Escherichia coli（ATCC 25922）標(biāo)準(zhǔn)菌株均來源于廣東省微生物菌種保藏中心（國家專利菌種保藏平臺）。

1.2 實驗樣品

市售某品牌飲料。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基（VRBA）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基。

1.4 試驗設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴鍋、振蕩器、微量移液器及槍頭、500 mL無菌錐形瓶、直徑90 mm無菌培養(yǎng)皿、不銹鋼過濾系統(tǒng)、孔徑0.45 μm無菌微孔濾膜。

1.5 實驗方法

1.5.1 平板計數(shù)法

樣品前處理：將新鮮培養(yǎng)的目標(biāo)菌制備成一定濃度的菌液，分別加入到飲料樣品中，使飲料樣品含菌液濃度為＜100 CFU/mL。

菌落總數(shù)[5]：按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》GB 4789.2-2016進(jìn)行檢驗，檢驗結(jié)果以CFU/mL為單位報告。

霉菌和酵母計數(shù)[6]：按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》GB 4789.15-2016第一法進(jìn)行檢驗，檢驗結(jié)果以CFU/mL為單位報告。

大腸菌群[7]：按照國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)》GB 4789.3-2016第二法（大腸菌群平板計數(shù)法）進(jìn)行檢驗，檢驗結(jié)果以CFU/mL為單位報告。

1.5.2 濾膜法

樣品前處理：將新鮮培養(yǎng)的目標(biāo)菌制備成一定濃度的菌液，分別加入到飲料樣品中，使飲料樣品含菌液濃度為＜100 CFU/mL，吸取1 mL含菌液飲料樣品到99 mL無菌飲料樣品中制備成100 mL待測樣品過濾，使飲料樣品含菌液濃度為＜100 CFU/100 mL。

過濾前先對不銹鋼過濾裝置進(jìn)行灼燒滅菌，然后用無菌平頭鑷子夾取一次性無菌濾膜放置在過濾頭上，安裝濾杯。在潔凈工作臺中進(jìn)行樣品的過濾操作，無菌條件下將100 mL待測樣品或樣品稀釋勻液加入濾杯中。打開真空泵開關(guān)進(jìn)行抽濾，當(dāng)全部液體通過濾膜后，再加100 mL無菌生理鹽水至濾杯，再次抽濾，當(dāng)全部液體通過濾膜后，關(guān)閉抽濾開關(guān)，移去濾杯，用無菌平頭鑷子移取濾膜至相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基上，平鋪并避免濾膜與培養(yǎng)基之間夾留著氣泡。將貼好濾膜的平板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。菌落總數(shù)測定、大腸菌群計數(shù)的平板置于 36 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng) 48 h±2 h；霉菌和酵母計數(shù)的平板置于28 ℃±1 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，觀察濾膜上生長的菌落情況并計數(shù)，報告結(jié)果。

1.5.3 預(yù)實驗

對濾膜法進(jìn)行線性分析，線性要求：截距=0斜率=1（95%的置信區(qū)間）。方法：將新鮮培養(yǎng)的目標(biāo)菌制備成一定濃度的菌液，分別加入到樣品中，使樣品含菌液濃度為500～100 CFU/100 mL以內(nèi)，分別過濾含相當(dāng)于 100 mL、10 mL、1 mL 樣品的 100 mL 過濾體積樣品，按照濾膜法進(jìn)行試驗，重復(fù)5次。根據(jù)所得的結(jié)果進(jìn)行線性分析，以驗證濾膜法本身的線性是否符合要求。

1.5.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計[8]

在本次試驗中，按照ISO 17994-2014《水質(zhì)-用兩種定量方法對比微生物回收率的基本要求》對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計比較。

1.5.5 數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換

兩種方法比較的過程中，采用相對差(xi)作為統(tǒng)計用的數(shù)據(jù)，相對差的計算見公式（1）：

式中：a-樣品經(jīng)實驗方法（膜過濾方法）檢測所得的一個結(jié)果；b-同一樣品經(jīng)參比方法(平板計數(shù)法)檢測所得的一個結(jié)果。

1.5.6 樣品量的確定

兩種菌落計數(shù)法比較所需的樣品量，在95%可信限上判斷給出的平均相對差的總樣品數(shù)(n)，由公式（2）確定：

式中：n-實驗的總樣品數(shù)量；s-標(biāo)準(zhǔn)偏差；L-最小顯著差。

在本試驗中，L=10。

有時候需要在一個與協(xié)同試驗不同的生態(tài)或地理環(huán)境下驗證等效性比較的結(jié)果。當(dāng)一個實驗室只需要驗證一個并被正式接受的方法時，可以充分利用以前的測試結(jié)果。實驗室應(yīng)能夠獲得協(xié)同試驗報告，相應(yīng)地，應(yīng)該也有相對差異的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差的估計值，這種情況，可用式（3）計算所需額外樣品數(shù)量。然而，不論計算結(jié)果如何，樣品數(shù)量都不應(yīng)少于30。

式中：n-所需的樣品數(shù)量；y-相對差異的標(biāo)準(zhǔn)差；以下兩數(shù)中較大的一個，見公式（4、5）。

式中：2L-兩種方法“沒有差異”時與擴展不確定度為 0的最大允許偏差，以%表示；ˉx-相對差異的算術(shù)平均數(shù)，以%表示。

1.5.7 統(tǒng)計量的計算

平均相對差（ˉx）用公式（6）計算：

式中：n-樣品數(shù)；xi-樣品i計數(shù)結(jié)果（ai與bi）的相對差異。

擴展不確定度數(shù)據(jù)S(即樣品結(jié)果的相對差）標(biāo)準(zhǔn)不確定度（標(biāo)準(zhǔn)差）用公式（7）計算：

計算：

擴展不確定度（W）為均數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以擴展引子（k=2），用公式（9）計算：

均數(shù)的擴展不確定度的置信區(qū)間，用公式（10、11）計算：

1.5.8 等效性的判定

等效性一般認(rèn)為是一種方法不會比另一種方法得出顯著高或顯著低的結(jié)果。在實際過程中，最大容許偏差在均數(shù)的擴展不確定度的置信區(qū)間覆蓋范圍內(nèi)即可認(rèn)為兩種方法具有等效性。

在本試驗中，為比較方法之間有無等效性，并沒有比較方法之間結(jié)果的高低，即為比較結(jié)果之間的差異有無統(tǒng)計學(xué)意義，故采用雙側(cè)檢驗。當(dāng)（xL＜-2L和xU＞0）或（xL＜0和xU＞+2L）時，視為數(shù)據(jù)不足，無法判斷，此時應(yīng)當(dāng)增加檢測樣品數(shù)量；當(dāng)(-2L≤xL≤0)和(0≤xU≤+2L)時，可認(rèn)為兩種方法無差異；當(dāng)(xL>-2L和xU＜0)，或(xL＞0 和xu＜+2L）法在統(tǒng)計學(xué)上有差異，但此差異太小無實際（微生物學(xué)）意義，此種情況下，統(tǒng)計學(xué)和實際應(yīng)用的結(jié)論有所不同，使用者可以根據(jù)自己情況自行選擇，從實際應(yīng)用的角度來看，可以認(rèn)為兩種方法是等效的；當(dāng)（xL>0）或者（xU<0）時，可以認(rèn)為兩種方法有差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾膜法重現(xiàn)性結(jié)果

圖1 菌落總數(shù)濾膜法線性關(guān)系圖Fig.1 The filter membrane linear relationship of aerobic plate count results

圖2 霉菌計數(shù)濾膜法線性關(guān)系圖Fig.2 The filter membrane linear relationship of enumeration of moulds results

圖3 酵母計數(shù)濾膜法線性關(guān)系圖Fig.3 The filter membrane linear relationship of enumeration of yeastes results

圖4 大腸菌群計數(shù)濾膜法線性關(guān)系圖Fig.4 The filter membrane linear relationship of enumeration of coliforms results

根據(jù)表1結(jié)果所得線性關(guān)系圖（圖1～4）可知在菌落總數(shù)、霉菌計數(shù)、酵母計數(shù)以及大腸菌群計數(shù)檢測中濾膜法對同一樣品不同體積的樣品結(jié)果具有較好的線性關(guān)系，可保證濾膜法的重現(xiàn)性。

2.2 濾膜法與平板計數(shù)法等效性評價結(jié)果

2.2.1 樣品量的確定

采集30份樣品進(jìn)行樣品量確定的預(yù)實驗，每個樣品同時進(jìn)行濾膜法和平板計數(shù)兩種方法檢測，統(tǒng)計量計算見表2。

根據(jù)表2中所示標(biāo)準(zhǔn)差，計算出各個項目檢查所需要的樣品量。

表1 濾膜法線性關(guān)系實驗結(jié)果Table 1 Linear relationship of filter method results

表2 預(yù)實驗中等效性檢驗統(tǒng)計分析結(jié)果Table 2 Statistical analysis results of equivalence test in pre-test(n =30)

菌落總數(shù)濾膜法與平板計數(shù)法比較需要的樣品量為31，預(yù)實驗采集樣品數(shù)量30個不能滿足樣品統(tǒng)計分析需求。霉菌計數(shù)濾膜法與平板計數(shù)法比較需要的樣品量為44，預(yù)實驗采集樣品數(shù)量30個不能滿足樣品統(tǒng)計分析需求。酵母計數(shù)濾膜法與平板計數(shù)法比較需要的樣品量為28，預(yù)實驗采集樣品數(shù)量30個能滿足樣品統(tǒng)計分析需求。大腸菌群計數(shù)濾膜法與平板計數(shù)法比較需要的樣品量為33，預(yù)實驗采集樣品數(shù)量30個不能滿足樣品統(tǒng)計分析需求。

根據(jù)樣品的確定量試驗，酵母計數(shù)能滿足樣品統(tǒng)計量分析，菌落總數(shù)、霉菌計數(shù)以及大腸菌群計數(shù)的樣品量均不能滿足統(tǒng)計分析，為更好進(jìn)行下一步分析，4個項目均按照同樣的方法增加檢測至100份樣品。

表3 等效性檢驗統(tǒng)計分析結(jié)果Table 3 Statistical analysis results of equivalence test(n=100)

根據(jù)表3中所示標(biāo)準(zhǔn)差，菌落總數(shù)、霉菌計數(shù)、酵母計數(shù)以及大腸菌群進(jìn)行等效性的統(tǒng)計分析所需要的樣品量為33、45、29、31，本實驗對100份樣品進(jìn)行檢測，滿足條件要求。

根據(jù)表3中所示置信區(qū)間的下限值和上限值，可知：

菌落總數(shù)濾膜法與平板法xL=-0.771，xU=10.746，滿足當(dāng)(-2L≤xL≤0)和(0≤xU≤+2L)時，表明兩種方法在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。

霉菌計數(shù)濾膜與平板法xL=-6.753，xU=7.093，滿足當(dāng)(-2L≤xL≤0)和（0≤xU≤+2L)時，表明兩種方法在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。

酵母計數(shù)濾膜法與平板法xL=0.659，xU=11.500，滿足當(dāng)(-2L≤xL≤0)和（0≤xU≤+2L)時，表明兩種方法在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。

大腸菌群計數(shù)濾膜法與平板法xL=2.672，xU=13.751，滿足當(dāng)（xL>-2L和xU＜0）或（xL＞0和xu＜+2L）時，表明兩種方法在統(tǒng)計學(xué)上有差異，但此差異太小無實際（微生物學(xué)）意義，在微生物學(xué)實際應(yīng)用中認(rèn)為結(jié)果無顯著差異。

可見本實驗所進(jìn)行的4個檢測項目：菌落總數(shù)、霉菌計數(shù)、酵母計數(shù)以及大腸菌群計數(shù)用濾膜法與平板計數(shù)法所得的數(shù)據(jù)分析后依據(jù)判斷標(biāo)準(zhǔn)可知濾膜法與平板計數(shù)法兩種檢測方法的等效性驗證結(jié)果無顯著差異，可以認(rèn)為兩種檢測方法在用于檢測可過濾液體飲料中菌落總數(shù)、霉菌計數(shù)、酵母計數(shù)以及大腸菌群計數(shù)時具有等效性。

3 結(jié)論

3.1 通過以上試驗證明濾膜法與平板計數(shù)法用于可過濾液體飲料檢測菌落總數(shù)、霉菌計數(shù)、酵母計數(shù)以及大腸菌群計數(shù)結(jié)果比較分析均無顯著差異，可作為評價可過濾液體飲料中微生物污染的方法。

3.2 此次試驗是比較的兩種不同方法的檢測結(jié)果的計數(shù)形式為CFU/mL，以及CFU/100 mL，本次采用的ISO 17994-2014，《水質(zhì)-用兩種定量方法對比微生物回收率的基本要求》可以進(jìn)行不同結(jié)果表示形式檢測方法之間法比較，且具有樣品量的具體要求和明確的等效性判斷標(biāo)準(zhǔn)，對微生物檢驗方法之間的比較具有指導(dǎo)意義[9～11]。

3.3 濾膜法主要起到富集微生物、分離去除樣品中對微生物生長產(chǎn)生干擾的因素的作用，可以有效提高檢測結(jié)果的零敏度和可靠性。本實驗選用孔徑為0.45 μm的濾膜，因為這是被認(rèn)作是微生物恢復(fù)和生長的標(biāo)準(zhǔn)濾膜，其應(yīng)用最為廣泛，兼顧了對微生物的高截流效率和對液體的快速過濾要求[12]。在操作過程中有更多的細(xì)節(jié)需要注意：采用不同直徑的濾膜，沖洗量應(yīng)先進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。使用時，應(yīng)保證濾膜在過濾前后的完整性。供試液經(jīng)濾膜過濾，總過濾量不得超過1000 mL，避免大體積，過高流速的沖洗造成濾膜上的微生物受損傷，濾膜貼于平板上不得有空隙或氣泡，否則影響微生物的生長。