袁亭亭，李曉鳳，袁琨

（1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（2.乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640）

葛根素有多種生理活性，在臨床上主要用于治療冠心病、高血壓、心絞痛和心率失常等心血管方面疾病，且已顯現(xiàn)出較好的療效；除此之外，葛根素還可以增加腦血流量，促進(jìn)人體腦循環(huán)，因此，常用于治療腦動(dòng)脈硬化、短暫腦缺血發(fā)作等腦血管疾病，且療效極佳[1,2]。然而，由于其結(jié)構(gòu)是異黃酮結(jié)構(gòu)，脂溶性 較差，造成其生物利用度較低[3]。已有研究表明，通過(guò)對(duì)黃酮類(lèi)化合物的?；揎椏梢杂行岣咂渲苄裕M(jìn)而能夠增強(qiáng)其生物利用率[4]。

目前可以對(duì)黃酮化合物?；揎椀姆椒ㄓ袀鹘y(tǒng)的化學(xué)法和酶催化的方法，但是采用常規(guī)化學(xué)法對(duì)黃酮化合物進(jìn)行選擇性的酰化修飾一般要經(jīng)過(guò)基團(tuán)保護(hù)、酯化、脫保護(hù)基團(tuán)等處理，此類(lèi)方法步驟繁雜，引入溶劑較多；利用酶法催化黃酮類(lèi)化合物的?；磻?yīng)可以避免上述這些問(wèn)題。脂肪酶，即三酰甘油酯水解酶（EC3.1.1.3），是一類(lèi)具有特殊性質(zhì)的酯酶，能在水不溶性體系或油水界面進(jìn)行催化反應(yīng)，具有立體選擇性、對(duì)映選擇性、底物專一性等諸多特點(diǎn)[5]。脂肪酶在有機(jī)溶劑體系和水體系中都具有較高的穩(wěn)定性和有效性，是一種非常重要的生物催化劑。在非水相介質(zhì)中，脂肪酶能催化水解反應(yīng)的逆反應(yīng)，主要包括酯化反應(yīng)和酯基轉(zhuǎn)移反應(yīng)（酯交換反應(yīng)、醇解反應(yīng)和酸解反應(yīng)）等合成型反應(yīng)[6,7]。

基于上述研究現(xiàn)狀，本研究探討了酶催化葛根素?；磻?yīng)的可行性，從8種水解酶中篩選出能高效催化葛根素丙?；磻?yīng)的生物酶制劑；探討了有機(jī)溶劑的種類(lèi)、反應(yīng)時(shí)間、水分含量和底物摩爾比等反應(yīng)參數(shù)對(duì)葛根素丙?；磻?yīng)的影響規(guī)律；并通過(guò)高效液相色譜、質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜等技術(shù)對(duì)所制備的黃酮酯類(lèi)產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，進(jìn)一步確定了產(chǎn)物主要是葛根素丙單酯。

1 材料與方法

1.1 材料

Novozym 435，來(lái)源于Candida Antarctica，type B；LipozymeIMTL，來(lái)源于Thermomyces lanuginosus；LipozymeIMRM，來(lái)源于Rhizomucor miehei；Novozym 435、LipozymeIMTL、LipozymeIMRM、豬胰脂肪酶、CRL酶均購(gòu)自諾維信公司；胰脂肪酶、肽酶、胃蛋白酶來(lái)自華南理工大學(xué)蛋白中心贈(zèng)送。

葛根素購(gòu)自上海Aladdin公司；丙酸乙烯酯（VP），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇，購(gòu)自德國(guó)Merck公司，色譜純；四氫呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、叔丁醇、乙腈、異丙醇、2-甲基四氫呋喃、石油醚、異辛烷、甲醇均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑公司，均為市售分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

Waters高效液相色譜儀，配備600控制器、2996光電二極管矩陣PDA紫外檢測(cè)器、717 Plus自動(dòng)進(jìn)樣器。色譜柱：4.6×250 mm(5 μm) Zorbax SB-C18 分析型色譜柱（Agilent Technologies Co, Ltd, USA）；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，型號(hào)：7890A/5975C，美國(guó)安捷倫公司；Bruker AV600型核磁共振儀，瑞士布魯克公司；移液槍（20 μL、100 μL、200 μL、1 mL 和 5 mL）：德國(guó)Eppendorf公司；FA2204B電子天秤：上海精密科學(xué)儀器有限公司；TW-3021HR冷凍離心機(jī)，安徽嘉文儀器裝備有限公司；高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo公司；HZQ-F100全溫氣浴振蕩培養(yǎng)箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 不同種類(lèi)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20 mmol/L葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯（VP），分別相應(yīng)地加40 mg/mL酶，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃、200 r/min）。定時(shí)取樣 100 μL，12000 r/min離心5 min后，取20 μL上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣20 μL，供分析。

1.3.2 反應(yīng)初速度、底物轉(zhuǎn)化率、區(qū)域選擇性的計(jì)算[8]

1.3.2.1 反應(yīng)初速度 V0值（Initial rate，mmol/(L·h)）

根據(jù)反應(yīng)開(kāi)始階段，單位時(shí)間內(nèi)葛根素的減少量來(lái)計(jì)算初始反應(yīng)速度：反應(yīng)初速度V0(mmol/(L·h))=(A0-Ai)/t。

其中：A0、Ai分別表示反應(yīng)前后葛根素的濃度（mmol/L），t為反應(yīng)時(shí)間（h）。

1.3.2.2 底物轉(zhuǎn)化率（Conversion，%）

根據(jù)底物反應(yīng)前后葛根素的峰面積的差值與反應(yīng)前葛根素峰面積之比值來(lái)計(jì)算轉(zhuǎn)化率：

轉(zhuǎn)化率C(%)=(S0-Si)/S0×100%。

其中：S0、Si分別表示反應(yīng)前后葛根素的峰面積。

1.3.2.3 區(qū)域選擇性（Regioselectivity，%）

根據(jù)目的?；a(chǎn)物的峰面積與所有?；a(chǎn)物的峰面積之比值來(lái)計(jì)算反應(yīng)的區(qū)域選擇性：

區(qū)域選擇性Regioselectivity(%)=Wi/Wtotal

其中：Wi表示目的酰化產(chǎn)物的峰面積，Wtotal表示所有酰化產(chǎn)物的峰面積之和。

1.3.3 高效液相色譜（HPLC）分析

儀器：Waters高效液相色譜儀：配備PDA紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；色譜柱：4.6×250 mm，5 μm Zorbax SB-C18 分析型色譜柱。

流動(dòng)相：63%甲醇-水溶液（含0.1%冰醋酸）；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.4 產(chǎn)物的分離純化與結(jié)構(gòu)鑒定

利用薄層色譜（TLC）對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化。首先，將含有機(jī)溶劑的反應(yīng)混合物在 10000 r/min下離心，除去脂肪酶催化劑，取上層反應(yīng)溶液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行真空減壓蒸餾，懸蒸2～3次，得到粗產(chǎn)物，溶解于一定量的甲醇中，完全溶解后，經(jīng)15000 r/min離心后，取上清液。利用薄層色譜對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，首先在GF254 25×75 mm硅膠板上確定展開(kāi)劑比例，再在GF254 100×200 mm的制備板上點(diǎn)樣，每次點(diǎn)樣1 μL，重復(fù)點(diǎn)樣3～5次。薄層層析結(jié)束后，用紫外燈（254 nm）觀察底物和產(chǎn)物條帶，收集含有產(chǎn)物的硅膠顆粒，用甲醇溶解，溶液離心后，取上清液。最后，真空干燥24 h得到葛根素酯。

葛根素和丙酸乙烯酯的反應(yīng)產(chǎn)物，用氯仿/甲醇/水=8/2/0.3(V/V/V)作為層析液。產(chǎn)物經(jīng)過(guò)分離純化，并通過(guò)HPLC進(jìn)行純度鑒定后，用超高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF-MS）、傅里葉紅外光譜（FT-IR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

FT-IR檢測(cè)：稱取1～2 mg經(jīng)過(guò)TLC純化的葛根素酯產(chǎn)物，與200 mg左右的溴化鉀研磨均勻，置于模具中，用壓片機(jī)將樣品壓成透明薄片，將產(chǎn)物樣品放到樣品架上，置于紅外光譜儀上分析，以葛根素為對(duì)照組。

1.3.5 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

在多個(gè)5 mL帶塞三角瓶中分別加入1 mL二甲基亞砜（DMSO）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙腈（acetonitrile）、甲醇（methanol）、2-甲基四氫呋喃（2-Me THF）、四氫呋喃（THF）、叔丁醇（tert-Butanol）、異丙醇（isopropanol）、石油醚（petroleum）和異辛烷（isooctane），再依次加入 20 mmol/L 葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯（VP），混合均勻。加入40 mg/mL Novozym 435催化劑后，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃，200 r/min）。定時(shí)取樣 100 μL，12,000 r/min離心5 min后，取20 μL上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，HPLC進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行檢測(cè)與分析。

1.3.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化葛根素?；磻?yīng)的影響

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20 mmol/L葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯（VP）和2 mg/mL Novozym 435催化劑混合均勻，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃、200 r/min）。定時(shí)取樣 100 μL，12000 r/min 離心 5 min 后，取 20 μL 上清液，用 63%甲醇-水溶液稀釋50倍，液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣20 μL，供分析。

1.3.7 水分含量對(duì)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20

mmol/L葛根素、600 mmol/L丙酸乙烯酯，混合均勻；再分別添加 0 μL/mL、10 μL/mL、20 μL/mL、30 μL/mL、50 μL/mL；加入 2 mg/mL Novozym 435 催化劑開(kāi)始反應(yīng)，置于氣浴恒溫?fù)u床上振蕩（40 ℃，180 r/min）。定時(shí)取樣，12000 r/min 離心 5 min 后取 20 μL 上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，HPLC進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行檢測(cè)與分析。

1.3.8 底物摩爾比對(duì)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

在5 mL帶塞三角瓶中加入1 mL四氫呋喃、20 mmol/L葛根素，分別加入100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L、700 mmol/L、800 mmol/L 丙酸乙烯酯（VP），混合均勻。加入 2 mg/mL Novozym 435 催化劑后，開(kāi)始反應(yīng)，在恒溫氣浴培養(yǎng)箱中振蕩反應(yīng)（40 ℃，200 r/min）。定時(shí)取樣 100 μL，12000 r/min 離心 5 min 后，取 20 μL上清液，用63%甲醇-水溶液稀釋50倍，HPLC進(jìn)樣20 μL，進(jìn)行檢測(cè)與分析。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，所有數(shù)據(jù)取三次重復(fù)的平均值；用Origin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合以及圖形化處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同脂肪酶催化葛根素酯合成反應(yīng)

為了篩選到能高效催化葛根素?；磻?yīng)的酶生物催化劑，以有機(jī)溶劑為反應(yīng)介質(zhì)，研究了3種固定化脂肪酶、3種游離脂肪酶、1種肽酶和1種胃蛋白酶在該酰化反應(yīng)中的催化效果。值得一提的是，從表1看，并非所有酶制劑都能高效催化葛根素的?；磻?yīng)。這主要是因?yàn)樗鼈兪遣煌瑏?lái)源具有底物[9,10]不同的識(shí)別特征的生物催化劑。

表1 不同酶催化葛根素丙?；姆磻?yīng)aTable 1 Acylation of puerarin with VP catalyzed by different lipasea

酶制劑是酶經(jīng)過(guò)提純、加工后的具有催化功能的生物制品，一般具有較高的底物選擇性，該特性與酶結(jié)構(gòu)、種類(lèi)及其來(lái)源密切相關(guān)。表2表明，不同來(lái)源的酶對(duì)葛根素丙?；磻?yīng)呈現(xiàn)出不同的催化活力。對(duì)葛根素丙?；磻?yīng)來(lái)說(shuō)，不同來(lái)源的脂肪酶均具有良好的催化活性。其中，采用固定化脂肪酶 LipozymeIMTL、LipozymeIMRM時(shí)，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上，初始速度分別為 19.64 mmol/L 和 24.56 mmol/L；Novozym 435也可以高效催化葛根素丙?；磻?yīng)，轉(zhuǎn)化率和初始速度分別為99.8%和25.0 mmol/L。采用2種游離脂肪酶的做催化劑時(shí)反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不高；其中采用豬胰脂肪酶時(shí)轉(zhuǎn)化率為67%，與固定化脂肪酶相比，催化效果不理想；肽酶和胃蛋白酶在非水相酶催化葛根素丙?；磻?yīng)中沒(méi)有表現(xiàn)出催化活性。

2.2 酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的高校液相色譜分析

圖1 Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)前(a)后(b)色譜圖Fig.1 Chromatograms of samples before (a) and after (b)acylation of puerarin catalyzed by Novozym 435

在本研究中，我們用 4.6×250 mm(5 μm)Zorbax SB-C18 分析型色譜柱（Agilent Technolgies Co, Ltd, USA），63%甲醇-水（水中含 0.1%乙酸），流速 0.5 min/mL，獲得了良好的底物和產(chǎn)物分離效果。在254 nm下可檢測(cè)葛根素及酯。如圖1所示，為葛根素反應(yīng)前后液相色譜圖，其中峰1為葛根素保留時(shí)間分別是11.6 min，反應(yīng)后在15.9 min位置出現(xiàn)了明顯的產(chǎn)物峰2，反應(yīng)后在20.9 min位置出現(xiàn)了明顯的產(chǎn)物峰3，從圖中很明顯可以看出葛根素單酯的色譜峰比較高，選擇性為98%。經(jīng)過(guò)薄層層析等分離純化過(guò)程，該產(chǎn)物被純化出來(lái)進(jìn)行了進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)鑒定。

2.3 酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的質(zhì)譜和紅外光譜分析

圖2 葛根素單酯（a）和葛根素雙酯（b）的高分辨率質(zhì)譜圖Fig.2 The mass spectrogram of PME (a) and PDE (b)

質(zhì)譜法是利用電場(chǎng)和磁場(chǎng)將運(yùn)動(dòng)的離子按它們的質(zhì)荷比分離后進(jìn)行檢測(cè)的方法，測(cè)出離子準(zhǔn)確質(zhì)量即可確定離子的化合物組成。圖2是葛根素單酯（a）和葛根素雙酯（b）的高分辨率質(zhì)譜圖。從圖中分析結(jié)構(gòu)顯示，能檢測(cè)到與葛根素單酯（C24H24NaO10，495.13m/z[M+Na]+）和葛根素雙酯（C27H28NaO11，551.15m/z[M+Na]+）的相對(duì)分子量。根據(jù)物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的紅外輻射的吸收特性，進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)和化學(xué)組分分析，所以利用FT-IR能有效鑒定出官能團(tuán)或化學(xué)鍵的存在或變化。圖3是葛根素（a）和葛根素酯（b）的傅里葉紅外光譜圖。相較于圖3 a，在圖3 b中1718 cm-1和2900 cm-1處出現(xiàn)了新的羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，分別為C=O特征峰（酯的典型吸收峰）和C-H特征峰，由此確定在葛根素結(jié)構(gòu)中加入丙酸酯基。

圖3 葛根素（a）及其酯（b）的傅里葉紅外光譜圖Fig.3 The FT-IR graph of Puerarin (a) and its esters (b)

2.4 反應(yīng)介質(zhì)對(duì)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

有機(jī)溶劑體系是影響黃酮類(lèi)化合物合成的一個(gè)重要因素，它通過(guò)改變酶的活性和穩(wěn)定性，影響反應(yīng)的初始速率和轉(zhuǎn)化率[11]。同樣，脂肪酶催化劑也顯示溶劑依賴性和細(xì)胞活性在不同有機(jī)溶劑體系變化較大[12,13]。因此，我們對(duì)不同有機(jī)溶劑系統(tǒng)對(duì)Novozym 435催化劑葛根素?；呋钚缘挠绊戇M(jìn)行了研究。

在前期實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)強(qiáng)極性有機(jī)溶劑能較好地溶解葛根素，但據(jù)報(bào)道，強(qiáng)極性有機(jī)溶劑會(huì)奪取酶活性中心的必需水，使之失去活力[14,15]。正如我們所預(yù)期的那樣（如表2所示），在強(qiáng)極性有機(jī)試劑DMSO和DMF中，葛根素有很高的溶解度，但Novozym 435在催化葛根素丙?；磻?yīng)中，并沒(méi)有表現(xiàn)出催化活性；在一般極性的異丙醇、叔戊醇有機(jī)溶劑體系中，Novozym 435催化劑表現(xiàn)出很低的催化活性，在反應(yīng)24 h時(shí)，轉(zhuǎn)化率分別僅為10.3%和8.7%。除了強(qiáng)極性有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響，也可能與溶劑溶解底物的能力有關(guān)，也就是說(shuō)底物分子葛根素很難離開(kāi)反應(yīng)介質(zhì)進(jìn)入酶的活性部位，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率低[16]。因此，在DMSO和DMF反應(yīng)介質(zhì)完全失去了Novozym 435催化劑的活性，而在異丙醇、叔丁醇反應(yīng)介質(zhì)中保持一點(diǎn)催化活力。

Novozym 435在催化葛根素丙?；磻?yīng)中，在有機(jī)溶劑THF和2-Me THF表現(xiàn)出很高的催化活性，轉(zhuǎn)化率分別為98.7%和97.5%，又因?yàn)楦鸶卦赥HF溶劑中比2-Me THF溶劑有較好的溶解度，Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)中，選擇有機(jī)試劑THF為最優(yōu)的試劑。

表2 不同有機(jī)溶劑對(duì)Novozyme 435催化葛根素?；磻?yīng)影響aTable 2 Effect of pure organic solvents on acylation of puerarin catalyzed by Novozyme. 435 lipasea

2.5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶催化葛根素?；磻?yīng)的影響

從圖4可以看出，轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)時(shí)間的增加而增加。在反應(yīng)0～3 h時(shí)間內(nèi)，酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率急劇上升，這是由于反應(yīng)初始階段葛根素與丙酸乙烯酯濃度較高且產(chǎn)物濃度較低，反應(yīng)向正向進(jìn)行；反應(yīng)3～6 h時(shí)間內(nèi)，酶促反應(yīng)速度不斷下降底物轉(zhuǎn)化率逐漸趨緩；在反應(yīng)6 h左右，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%，然后通過(guò)進(jìn)一步延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率幾乎沒(méi)有改變，反應(yīng)基本達(dá)到平衡狀態(tài)。因此，通過(guò)Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)達(dá)到熱力學(xué)平衡狀態(tài)時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為6 h，值得一提的是，在這項(xiàng)研究中，Novozym 435催化葛根素丙?；磻?yīng)中獲得的轉(zhuǎn)化率高于以往的研究報(bào)道。我們可以得出結(jié)論，Novozym 435催化劑能高效催化葛根素丙?；磻?yīng)。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Novozym 435催化葛根素?；磻?yīng)的影響Fig.4 Effect of time on acylation of puerarin by Novozyme. 435

2.6 水分含量對(duì)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

圖5 水分含量對(duì)Novozym 435催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of water content on acylation of puerarin by Novozyme. 435

很多研究認(rèn)為酶分子需要一定的水分來(lái)保持酶的活性與反應(yīng)的進(jìn)行，但是高水分會(huì)使酶分子結(jié)合導(dǎo)致反應(yīng)速率的大幅度下降[17]，所以說(shuō)，酶分子水分含量需要保持在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)。一般研究水分對(duì)反應(yīng)的影響有兩種方法，一是研究水分活度aw來(lái)確定最佳水分用量[18,19]，二是溶劑中添加的水分的含量，這種方法操作方便，特別是適用于工業(yè)應(yīng)用，便于操作[19,20]；本研究中也采用水分體積含量考察水對(duì)脂肪酶催化葛根素丙?；磻?yīng)的影響。從圖5中可以看出反應(yīng)初速度與轉(zhuǎn)化率都是隨著水分含量的增加呈現(xiàn)遞減的；但是區(qū)域選擇性沒(méi)有發(fā)生較大變化。對(duì)于該催化反應(yīng)體系來(lái)說(shuō)，水分的存在反而會(huì)降低酶的活性，水分含量為0，Novozym 435催化葛根素酰化反應(yīng)的催化效率最高。

2.7 底物摩爾比對(duì)酶催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響

圖6 底物摩爾比對(duì)Novozym 435催化葛根素酯合成反應(yīng)的影響Fig.6 Effect of molar ration of substrate on acylation of puerarin by Novozyme. 435

轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是一個(gè)可逆反應(yīng)，即葛根素的轉(zhuǎn)酯合成與酯的水解會(huì)同時(shí)發(fā)生。當(dāng)一種反應(yīng)底物過(guò)量時(shí)，有利于熱力學(xué)平衡向酯合成方向進(jìn)行。本研究考察了丙酸乙烯酯與葛根素的摩爾比對(duì)Novozym 435催化葛根素丙?；磻?yīng)的影響（圖 6）。VP/葛根素的摩爾比從5增加到30（mol/mol），反應(yīng)速率和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率顯著提高，區(qū)域選擇性變化不大。VP/葛根素的摩爾比從30增加到40（mol/mol），反應(yīng)速率和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率幾乎沒(méi)有變化，區(qū)域選擇性變化不大。因此，綜合考慮轉(zhuǎn)化率和底物摩爾比之間的關(guān)系，我們選擇 30:1（VP:葛根素（mol/mol））作為該反應(yīng)的最佳底物摩爾比，此時(shí)葛根素的?；磻?yīng)的轉(zhuǎn)化率為99.5%，初始速度22.1 mmol/(L·h)。

3 結(jié)論

本研究從8種不同種類(lèi)的水解酶中篩選可以高效催化葛根素丙?；磻?yīng)的酶，成功篩選到3種脂肪酶能高效催化非水相葛根素丙酰化反應(yīng)，并以脂肪酶Novozym 435催化葛根素丙?；磻?yīng)為模型，研究了反應(yīng)時(shí)間、有機(jī)溶劑種類(lèi)、水分含量、底物摩爾比等對(duì)該模型的影響規(guī)律。研究結(jié)果表明：選擇以四氫呋喃為反應(yīng)溶劑，2 mg/mL Novozym 435脂肪酶，底物：?；w之比為1:30，轉(zhuǎn)速200 r/min，水分含量為0的反應(yīng)條件下，反應(yīng)6 h，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到99.5%。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)分離純化后進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，高效液相色譜、質(zhì)譜、傅里葉紅外光譜結(jié)果表明，非水相酶催化葛根素酰化反應(yīng)，所得產(chǎn)物酯為葛根素丙單酯，區(qū)域選擇性達(dá)98%。Novozym 435可以快速、高效催化葛根素丙酰化反應(yīng)，本研究工作將為脂肪酶Novozym 435為代表的生物催化劑在黃酮類(lèi)化合物中的酰化修飾反應(yīng)提供理論依據(jù)。