晉海軍，王海霞，張 濤，向守艷

（貴陽中醫(yī)學院，貴陽 550025）

太子參（Pseudostellariae Radix）為石竹科植物孩兒參 Pseudostellaria heterophylla（Miq.）Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，具有益氣健脾、生津潤肺的功效，用于脾虛體倦、食欲不振、病后虛弱、氣陰不足、自汗口渴以及肺燥干咳等癥[1]。貴州省施秉縣于1992年引種太子參，經(jīng)過起步、摸索、擴張和發(fā)展等階段，現(xiàn)已形成以太子參為主導品種的中藥材生產(chǎn)格局，并躍居成為我國太子參第二大產(chǎn)區(qū)[2]。

根據(jù)傳統(tǒng)的“辨狀論質(zhì)”思想和近幾年太子參商品規(guī)格等級標準研究進展，太子參的參形是其商品規(guī)格等級劃分的一個重要量化指標[3-4]。目前尚無有關太子參參形差異形成的研究報道，但有關植物蛋白與根形形成相關的報道較多。R.D.Smith等[5]研究發(fā)現(xiàn)蛋白磷酸激酶與擬南芥根毛區(qū)細胞生長和根皮層細胞形狀形成有關。T.I.Baskin和J.E.Wilson[6]也指出蛋白激酶和磷酸酶與植物根系形態(tài)的形成有關。A.Grabov等[7]報道，參與生長素轉(zhuǎn)運、細胞骨架形成的蛋白與植物根形的形成有關。太子參參形的形成，可能也與參與某些細胞代謝通路的關鍵蛋白有關。因此有必要利用蛋白質(zhì)組學技術對太子參參形形成的分子機制展開研究。本研究擬通過對不同參形太子參蛋白提取方法的篩選、提取工藝的優(yōu)化及蛋白條帶的分析，為今后在蛋白質(zhì)組層面揭示不同參形形成的分子機制提供基礎資料。

1 材料和方法

1.1 試驗儀器與試劑

UPT-II-20T優(yōu)普UPT系列超純水器，四川優(yōu)普超純科技有限公司；SIM-F124雪花制冰機，北京長流科學儀器有限公司；TOMYEs-315高壓蒸汽滅菌鍋，日本 TAKARA TOMY股份公司；Centrifuge J810R臺式冷凍離心機，德國eppendorf公司；GBC Cintra20/20051254紫外可見分光光度計，澳大利亞GBC科學儀器公司；DYCZ-28A電泳儀，北京市六一儀器廠；XW-80A微型漩渦混合儀，上海馳唐電子有限公司；ME204/02萬分之一電子天平，美國梅特勒-托利多公司；BIO-DL移液器，蘇州百得實驗室儀器有限公司。

預染蛋白質(zhì)Maker II和SDS-PAGE凝膠試劑盒，武漢博士德生物；0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），南寧恒因生物；牛血清蛋白，上海展云化工有限公司；考馬斯亮藍 G250、4%CHAPS和 0.2%Bio-Lyte，美國 Bio-Rad 公司；二硫蘇糖醇（DTT）和尿素，美國GE公司；乙二胺四乙酸二鈉和十二烷基磺酸鈉（SDS），上海申博化工有限公司；無水乙醇，重慶川東化工集團有限公司；甲醇，國藥集團化學試劑有限公司；甘氨酸，上海藍季科技發(fā)展有限公司；溴酚藍，上海三愛思試劑有限公司；乙酸銨，西隴化工股份有限公司；磷酸，重慶川東化工集團有限公司；甘油，上海申博化工有限公司；冰醋酸，西隴化工股份有限公司。

1.2 試驗材料

太子參采自貴州施秉縣牛大場太子參種植基地，經(jīng)貴陽中醫(yī)學院江維克教授鑒定為石竹科植物孩兒參的塊根。參照太子參商品規(guī)格等級劃分[3]，太子參參形分為3個等級。一等：長紡錘形（中上部直徑≥4.46 mm），單個重量≥0.45 g，直立；二等：長紡錘形（中上部直徑3.35～4.45 mm），單個重量0.3～0.44 g，較直立；統(tǒng)貨：細長紡錘形或長條形（中上部直徑≤3.34 mm），單個重量≤0.29 g，彎曲明顯。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白質(zhì)的提取

采用 Tris-HCl[8-9]、TCA-丙酮法[10-11]和酚抽提法[12-13]提取不同參形太子參的蛋白。

采用Tris-HCl法，取-80℃冰箱冷凍保存的3種參形（一等、二等和統(tǒng)貨）太子參塊根4.0 g放入研缽中，液氮迅速研磨成粉末，將粉末裝入離心管；加入10 mL蛋白質(zhì)提取緩沖液（65 mmol/L Tris-HCl pH 6.8，0.5%SDS，10%甘油，5% β-巰基乙醇）混勻；將離心管置于冰上10 min左右，每隔2 min震蕩一次，確保蛋白粉末與緩沖液充分接觸；放入4℃冰箱浸提1 h；4℃，15 000 r/min離心15 min；取蛋白上清液，加入3倍體積-20℃預冷的10%TCA丙酮溶液，充分混勻，置于-20℃冰箱1 h，使蛋白質(zhì)沉降；4℃，15 000 r/min離心15 min，棄上清；沉淀用預冷丙酮洗滌1次，80%預冷丙酮洗滌2次；4℃，15 000 r/min離心15 min，放于冰上將丙酮自然揮干，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TCA-丙酮法，取-80℃冰箱冷凍保存的3種參形太子參塊根4.0 g放入研缽，加液氮迅速研成粉末，將粉末裝入離心管；加入4 mL預冷的丙酮溶液（含 10%TCA（W/V），0.07% β-巰基乙醇（V/V），混勻后于-20℃下放置2.5 h（其間振蕩幾次）；然后在4℃條件下15 000 r/min離心20 min；棄上清液，用預冷的80%丙酮溶液重懸沉淀，重復以上操作3次，清洗至上清液無色；離心后再用-20℃預冷丙酮重懸沉淀，于-20℃冰箱內(nèi)靜置1 h；4℃條件下15 000 r/min離心30 min，用預冷丙酮重懸沉淀2次，棄上清；沉淀置于冰上，自然揮發(fā)干丙酮，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用酚抽提法，取-80℃冰箱冷凍保存的3種參形太子參塊根4.0 g放入研缽中，加入液氮研磨成粉末，將粉末裝入離心管中；加入4 mL的飽和酚（pH 8.0，Sigma）和 4 mL 的 SDS（30%蔗糖；2%SDS；0.1 mol/L Tris-HCl，pH8.0；5%的 β-巰基乙醇）緩沖液，振蕩 30 s；4 ℃、15 000 r/min，離心 10 min，上層酚相轉(zhuǎn)移到離心管中；加入5倍體積的含有0.1 mol/L乙酸胺的甲醇，混合后在-20℃的條件下沉淀30 min；4 ℃、15 000 r/min，離心 15 min，棄上清；沉淀用冷丙酮漂洗 2次（4 ℃、15 000 r/min，離心 10 min）；最后將沉淀置于冰上將丙酮自然揮干，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定

將提取的2 mg蛋白干粉加入400 μL裂解液（7 M 尿素，4%CHAPS，2 M 硫脲，0.2%Bio-Lyte和65 mM DTT）中，溫控搖床4℃裂解3 h；15 000 g，4℃離心20 min，取上清液即為蛋白樣品液。蛋白的定量采用Bradford法[14]。標準蛋白選用牛血清白蛋白（BSA）加入Bradford工作液，測其在595 nm處的吸光值，繪制標準曲線，測量待測樣品蛋白的吸光度值，并計算樣品蛋白濃度。

1.3.3 蛋白質(zhì)的SDS-PAGE檢測

將Tris-HCl法制備的蛋白干粉室溫下用蛋白裂解液（含 100 μmol/L 的 DTT、2%SDS）裂解 1 h，在沸水浴中煮沸5 min，而后進行SDS-PAGE電泳。電泳、染色、脫色、固定采用胡朝敦等[15]的方法。

1.3.4 蛋白提取工藝的響應面優(yōu)化

選取料液比、提取溫度、pH值和提取時間4個因素進行試驗，每個因素設計3個水平，用Design Expert V8.0.5b軟件的Box-Benhnken試驗方案進行響應面優(yōu)化（見表1）。

表1 Box-Benhnken試驗因素水平表Table1 Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 太子參蛋白提取方法篩選

以Tris-HCl、TCA-丙酮法和酚抽提法提取不同參形太子參的蛋白。試驗結(jié)果顯示（見表2）3種植物蛋白提取方法中Tris-HCl法所得蛋白含量較高，TCA/丙酮法次之，酚抽提法得到蛋白含量較低。因此，Tris-HCl法是提取太子參蛋白最佳方法，特別對于一等太子參蛋白的提取效果更佳。

表2 3種方法所提蛋白含量Table2 Protein content for three methods

2.2 太子參蛋白的SDS-PAGE檢測分析

由3個等級太子參蛋白SDS-PAGE電泳圖（圖1）可知，太子參蛋白的分子量大致分布在10 kDa～90 kDa之間，3種等級太子參蛋白條帶的分布沒有明顯差異，但表達量有所區(qū)別。一等太子參在15 kDa處的蛋白表達量明顯高于其他兩個等級太子參，其他分子量的蛋白條帶差異不大，唯獨此處差異明顯，可能此處的蛋白質(zhì)與不同參形的形成相關。

圖1 3個等級太子參蛋白SDS-PAGE電泳圖Figure1 SDS-PAGE electrophoresis of three grades of Pseudostellariae Radix protein

2.3 太子參蛋白提取工藝響應面優(yōu)化

目前，僅有對太子參蛋白提取方法的少量報道[16]，尚無對太子參蛋白質(zhì)提取工藝流程優(yōu)化的報道。本研究對太子參蛋白提取中篩選的最佳方法Tris-HCl法進行響應面優(yōu)化實驗，依據(jù)Box-Benhnken實驗原理，響應值為蛋白質(zhì)定量的吸光度值（OD值），試驗方法為4因素（料液比、提取溫度、pH值和提取時間）3水平的響應面分析法，24個分析因子（1～24），3個中心試驗點（25～27），共有 27個試驗點，結(jié)果見表3。

表3 Box-Benhnken試驗設計與結(jié)果Table3 Box-Benhnken experimental design matrix and results

2.3.1 響應面實驗模型的建立與顯著性檢驗

對表3中的數(shù)據(jù)用Design Expert V 8.0.5b軟件進行回歸擬合，得吸光度值對4個影響因素的回歸方程預測模型：

OD=0.39+0.051A+6.867×10-3B-8.000×10-3C+0.035D+0.022AB-0.021AC+0.027AD+0.015BC+0.043BD+0.058CD-0.10A2-0.034B2-0.040C2+0.011D2。

對此方程進行方差分析，結(jié)果如表4所示，預測的回歸方程顯著性較高，且失擬項不顯著（P=0.265＞0.05），R2=0.999 2。所以模擬的回歸方程具有較高的擬合度與可信度。

2.3.2 響應面分析與優(yōu)化

響應面曲線圖和等高線圖是Design Expert V8.0.5b軟件根據(jù)預測回歸方程做出的，可直觀反映提取溫度、提取時間、料液比和pH值4個因素對吸光度值的影響。響應面曲線圖反映了任意兩個因素對吸光度值的影響，響應面曲線圖所映射的等高線圖反映了兩個因素之間的相關性，等高線圖越接近橢圓形，則兩個因素間的相關性越大。如圖2中顯示，pH值和料液比對吸光度的影響最顯著，等高線接近橢圓形，表示溫度和料液比具有很大相關性；溫度和料液比對吸光度有顯著影響，兩因素間相關性較大；時間和料液比一定程度上影響著吸光度，兩因素間存在一定的相關性但不顯著；pH值和溫度對吸光度有一定的影響，彼此有一定的相關性但不顯著；時間和溫度、時間和pH值對吸光度有一定影響，但彼此之間沒有相關性。

表4 響應面二次回歸方程模型的方差分析Table4 Analysis of variance for each term in the fitted regression model

2.3.3 驗證性實驗

對預測回歸方程求一階偏導令其為0，得到太子參蛋白的最佳測定條件為：料液比1∶1.32，提取溫度25℃，pH值7.47，提取時間1.5 h，預測理論吸光度為0.994 0。用最佳條件對太子參蛋白進行提取，測量吸光度（重復測量3次），結(jié)果見表5。吸光度測量值0.983 8與理論值0.994 0之間的相對誤差為1.03%，說明Box-Benhnken實驗所得最優(yōu)檢測條件準確可靠。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)太子參商品規(guī)格等級劃分[3]，太子參參形可分為3個等級。目前尚無影響太子參參形的內(nèi)在分子機制報道，本研究通過篩選太子參蛋白的提取方法及對提取工藝的響應面優(yōu)化，并對所提不同參形太子參蛋白的SDS-PAGE分析，以期得到太子參蛋白的最佳提取工藝及不同參形太子參蛋白條帶差異，為今后在蛋白組層面利用分子植物育種技術選育參形較好的太子參新品種提供基礎資料。

本實驗用紫外分光光度法，對3種蛋白提取方法（Tris-HCl法、TCA-丙酮法、飽和酚法）所得的不同參形太子參蛋白進行定量，并進行SDS-PAGE檢測分析。結(jié)果顯示，利用Tris-HCl法所提取蛋白質(zhì)含量較高且蛋白條帶清晰。劉楊等[17]也指出，用Tris-HCl法提取黃芪蛋白效果明顯優(yōu)于TCA-丙酮法和飽和酚法。朱燕芳等[18]用Tris-HCl法對地瓜參進行處理，證明Tris-HCl法處理的地瓜參蛋白提取效率最高。與Tris-HCl法相比，TCA-丙酮法需要用80%預冷丙酮和冷丙酮重懸多次，蛋白損失相對較多，導致在SDS-PAGE時即使上樣量多于Tris-HCl法，蛋白條帶也沒有Tris-HCl法清晰；相比之下飽和酚法所提取的蛋白含量較少，原因可能是飽和酚法不適和太子參蛋白的提取。劉楠等[19]利用TCA-丙酮法和飽和酚法提取蒙古沙冬青根蛋白，證明飽和酚法提取蛋白效果最好?？赡苡捎谔訁⒑兔晒派扯喔锌偟鞍壮煞旨昂懈蓴_蛋白提取的成分不同，導致二者選用的蛋白提取方法不同。

圖2 各兩因素交互作用的響應面和等高線圖Figure2 Response surface and contour of the any two factors on the yield of Pseudostellariae Radix protein

表5 驗證試驗Table5 Verification experiment

通過對3個不同等級太子參SDS-PAGE電泳圖譜分析，發(fā)現(xiàn)3個等級太子參蛋白條帶分布沒有明顯差異，但蛋白表達量有一定差異，特別是一等參在15 kDa處的蛋白表達量明顯高于二等參和統(tǒng)貨，可能此處的蛋白質(zhì)與不同等級參形的形成有關。Y.Stahl和R.Simon[20]也指出一些低分子量的多肽和受體類蛋白對于植物根的生長發(fā)育及根形的形成至關重要。日后本課題組將通過雙向電泳、質(zhì)譜分析與生物信息學技術進一步分析分子量15 kDa處蛋白的種類及其參與的代謝通路，以期進一步闡釋不同參形形成的分子機理。

本研究首次采用響應面優(yōu)化法對太子參蛋白的提取工藝進行優(yōu)化，得到的最佳優(yōu)化條件與韓景華等[21]、夏琨[22]利用Tris-HCl緩沖液對植物蛋白提取工藝的優(yōu)化結(jié)果不同，其中的原因可能是：二者選用的實驗材料不同、緩沖液的配比不同、提取條件不同等。本次實驗得到太子參蛋白的最佳提取工藝條件為：料液比1∶1.32，提取溫度25℃，pH值7.47，提取時間 1.5 h。