周 宇，李 晶，鮑翠玉

(湖北科技學(xué)院 1. 藥學(xué)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

隨著人們生活水平的不斷提高，糖尿病(diabetes mellitus，DM)的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢[1]。糖尿病心肌病(diabetes cardiomyopathy，DCM)是一種相對于先天性心臟病、高血壓心臟病、冠狀動脈粥樣硬化、心臟瓣膜性病變和其他心臟病來說獨立發(fā)生的疾病，會改變心臟正常功能，導(dǎo)致心肌缺血和心力衰竭[2]。各種因素都有可能參與DCM的發(fā)生與發(fā)展，比如炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、心肌細胞中的糖脂代謝紊亂、心肌纖維化和心肌細胞凋亡都被認為是DCM的發(fā)病機制[3]。棕櫚酸(palmitic acid，PA)是血漿中含量最豐富的游離脂肪酸，持續(xù)高脂的刺激會造成心肌細胞的功能損傷，激活凋亡信號通路中的信號分子caspase、Bax、Bcl-2以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)信號通路，誘導(dǎo)細胞凋亡[4]。

姜黃素具有降血脂、抗腫瘤、抗炎、利膽、抗氧化等作用，治療代謝相關(guān)性疾病，但由于姜黃素本身雙苯環(huán)結(jié)構(gòu)所致，其水溶性很低，生物體內(nèi)攝取率低，血液清除率高，進而生物利用率低下，限制了姜黃素在臨床治療中的應(yīng)用。納米藥物遞送系統(tǒng)，尤其是納米高分子藥物遞送系統(tǒng)能明顯改善姜黃素水溶性差、生物利用率低等缺陷[5]，在姜黃素藥物制劑制備領(lǐng)域表現(xiàn)出良好前景?；诖?，本研究建立高脂誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型，研究姜黃素納米粒(curcumin nanoparticles，Cur-NPs)對高脂誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用及機制，為Cur-NPs在心血管疾病方面的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 H9c2心肌細胞購于上海通派生物有限公司。

1.1.2試劑 Cur-NPs由中國科學(xué)研究院長春應(yīng)用化學(xué)研究所高分子物理與化學(xué)研究課題組提供。高糖DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清、MTT(美國Gibco公司)；棕櫚酸(美國Sigma公司)；DAPI染液(武漢谷歌生物有限公司)；細胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)試劑盒、ECL試劑盒(美國Thermo Scientific公司)；TUNEL試劑盒(美國Roche公司)；BCA試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；抗Bcl-2、Bax、GRP78、CHOP抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.1.3儀器 超凈工作臺(蘇州安泰公司)；CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)；HVE-50高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國SYNGENE公司)；垂直式電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) H9c2心肌細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清和100 kU·L-1雙抗的高糖DMEM中，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，細胞充分貼壁生長融合至80%時，用含0.25% EDTA胰酶消化傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2PA的配制 準備EP管裝有1 mL無水乙醇，用分析天平精準稱取PA粉末25.642 mg，把稱好的PA粉末倒入無水乙醇中，將EP管放入37℃水浴鍋中輕搖震蕩至完全溶解。然后使用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，過濾后的儲存液濃度為100 mmol·L-1，使用前37℃水浴鍋將PA儲存液完全溶解至無沉淀物。給藥時，用含5% BSA的DMEM稀釋使用。

1.2.3Cur-NPs的配制 用分析天平精準稱取Cur-NPs粉末85 mg，溶于1 mL 1×PBS中，超聲至完全溶解，無需過濾。

1.2.4實驗分組 (1)PA濃度梯度：設(shè)為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1，進行MTT檢測；(2)PA時間梯度：設(shè)為12、24、48 h，進行MTT檢測；(3)PA濃度設(shè)為0.4 mmol·L-1，Cur-NPs濃度梯度設(shè)為0、20、40、80、160、200 μmol·L-1，進行MTT檢測；(4)Cur-NPs藥物療效檢測：設(shè)為正常對照組、PA 0.2 mmol·L-1、PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1、PA 0.4 mmol·L-1、PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1，進行ROS、TUNEL及免疫印跡檢測。

1.3檢測指標(biāo)

1.3.1MTT法檢H9c2心肌細胞增殖率 在96孔板中接種H9c2心肌細胞懸液(每孔1×106細胞，每孔100 μL)，每組設(shè)置6個復(fù)孔。將96孔板放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞完全貼壁，向每孔加入不同濃度含PA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間。棄去孔內(nèi)上清液，每孔加入20 μL的5 g·L-1MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀讀取在570 nm處的吸光度值，按照以下公式計算細胞增殖率：細胞增殖率/%=實驗組吸光度值/正常對照組吸光度值×100%。

1.3.2細胞ROS檢測 在24孔板中接種H9c2心肌細胞，向每孔分別加入不同濃度含PA的高糖DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用不含胎牛血清的DMEM清洗2遍，按1 ∶500的比例用不含胎牛血清的DMEM配制ROS試劑盒試劑，每孔加入500 μL配制好的試劑，細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI染液，避光室溫靜置10 min，1×PBS清洗2遍后收集細胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑封片。在倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察，拍照。

1.3.3TUNEL檢測 在24孔板中接種H9c2心肌細胞，每孔分別加入不同濃度含PA的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，1×PBS清洗2遍，4%多聚甲醛室溫固定1 h，3%過氧化氫封閉10 min，0.1% Triton X-100滲透孵育2 min，1×PBS清洗2遍后，每孔加入50 μL TUNEL檢測試劑，放回細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。用1×PBS清洗2遍，向每孔滴加1滴DAPI染液，避光室溫靜置10 min，1×PBS清洗2遍后收集細胞爬片，用抗熒光淬滅封片劑封片。在倒置熒光顯微鏡20倍鏡下觀察，拍照。

1.3.4蛋白免疫印跡法檢測 H9c2心肌細胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基，用1×PBS清洗2遍，加入裂解液，收集裂解液，離心取上清液， BCA法測定蛋白濃度。取合適量的總蛋白在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離，轉(zhuǎn)膜后，在5%脫脂牛奶中封閉2 h。PVDF膜一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜后，二抗室溫孵育1 h。將PVDF膜與ECL顯影液充分接觸后，在化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)中檢測凋亡信號通路蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2，以及ERS信號通路蛋白GRP78、CHOP蛋白表達情況。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0與GraphPad Prism7軟件分析處理，兩組數(shù)據(jù)間差異采用t檢驗進行計算。

2 結(jié)果

2.1高脂刺激對H9c2心肌細胞增殖率的影響Fig 1A結(jié)果顯示，不同濃度PA(0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)刺激H9c2心肌細胞24 h時，增殖率分別為101.4%、106.6%、102.2%、106.6%、71.7%和54.0%。與正常對照組相比，PA 0.4 mmol·L-1刺激心肌細胞24 h時，細胞增殖率開始出現(xiàn)明顯下降(P<0.01)。Fig 1B結(jié)果表明，0.4 mmol·L-1PA刺激H9c2心肌細胞0、12、24、48 h時，高脂所致的心肌細胞增殖率出現(xiàn)時間依賴性降低現(xiàn)象，PA 0.4 mmol·L-1刺激心肌細胞24 h時，細胞增殖率出現(xiàn)50%以上下降(P<0.01)。因此，在MTT實驗中，我們將PA濃度設(shè)為0.4 mmol·L-1，刺激時間設(shè)為24 h[6]。

2.2Cur-NPs改善高脂誘導(dǎo)的心肌細胞增殖能力低下如Fig 2A所示，小分子姜黃素不溶于水，溶 于DMSO，而納米化的姜黃素溶解于水溶液，提示Cur-NPs在溶解度方面優(yōu)于小分子姜黃素，而溶解度的提高將有助于提高藥物的穩(wěn)定性及生物利用度，大大改善其療效，降低毒性。Fig 2B結(jié)果表明，當(dāng)0.4 mmol·L-1PA刺激24 h時，H9c2心肌細胞的增殖能力明顯降低，而不同濃度Cur-NPs預(yù)處理，可以不同程度改善高脂誘導(dǎo)的心肌細胞增殖能力的損傷，與PA組的29.4%比較，Cur-NPs(20、40、80、160、200 μmol·L-1)預(yù)處理組，細胞增殖率分別為45.9%、64.0%、70.8%、80.4%、84.4%。隨著Cur-NPs的濃度的升高，細胞增殖率呈現(xiàn)濃度依賴性升高趨勢，提示Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的心肌細胞增殖率的損傷有明顯的改善作用，在后續(xù)實驗中選擇Cur-NPs為200 μmol·L-1。

2.3Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的細胞氧化損傷的影響如Fig 3所示，與正常對照組比較，PA濃度為0.2 mmol·L-1時，細胞中ROS水平有所增加，細胞數(shù)目有所減少，另外，細胞出現(xiàn)輕微形態(tài)學(xué)改變，如細胞體積縮小、連接減少、細胞質(zhì)密度增加、核質(zhì)濃縮、核膜核仁破碎。當(dāng)PA濃度為0.4 mmol·L-1時，細胞數(shù)量急劇減少，細胞質(zhì)與細胞核均發(fā)生不同程度的改變，表現(xiàn)為細胞脹大、胞膜破裂、細胞內(nèi)容物外溢等現(xiàn)象。Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的心肌細胞氧化損傷有明顯改善作用，PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1與PA 0.2 mmol·L-1相比，細胞形態(tài)更加完整，細胞膜破裂情況消失。PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1組相比，細胞數(shù)目接近于正常對照組，細胞質(zhì)與細胞核的形態(tài)也接近于正常對照組。

Fig 1 Effect of high fat on proliferation of H9c2

**P<0.01vscontrol group

Fig 2 Solubility and anti-cell damage efficacy of curcumin nanoparticles

2.4Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的細胞凋亡的影響Fig 4A結(jié)果表明，與正常對照組比較，PA濃度為0.2 mmol·L-1時，細胞數(shù)目有所減少，細胞質(zhì)與細胞核均發(fā)生輕微形態(tài)學(xué)改變。PA 0.4 mmol·L-1與正常對照組相比，TUNEL標(biāo)記的紅色熒光明顯增強，但細胞數(shù)目出現(xiàn)明顯減少，細胞質(zhì)與細胞核均發(fā)生明顯的細胞凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變，如核固縮、核碎裂、胞膜破裂、細胞內(nèi)容物外溢等。Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡有明顯改善作用， PA+Cur-NPs組與PA組相比，TUNEL標(biāo)記的紅色熒光明顯降低，細胞數(shù)目與細胞形態(tài)基本恢復(fù)正常，接近于正常對照組。

如Fig 4B所示，PA 0.2 mmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1組caspase-3蛋白的表達水平與正常對照組相比明顯增高(P<0.01)，當(dāng)PA濃度為0.2 mmol·L-1時，Bax/Bcl-2比值與正常對照組相比明顯增高(P<0.05)；PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1組caspase-3蛋白的表達水平相對于PA0.2 mmol·L-1與PA 0.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.01)，PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1組Bax/Bcl-2比值相對于PA 0.2 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05)。

Fig 3 Effect of Cur-NPs on PA-induced cardiomyocyte oxidative damage(×20)

1：Control; 2：PA 0.2 mmol·L-1; 3：PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1; 4：PA 0.4 mmol·L-1; 5：PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1.

Fig 4 Effect of Cur-NPs on apoptosis of cardiomyocytes induced by PA

2.5Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的心肌細胞ERS信號通路激活的影響如Fig 5所示，PA 0.4 mmol·L-1組GRP78和CHOP蛋白的表達水平與正常對照組相比明顯增高(P<0.05)，PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1組GRP78和CHOP蛋白的表達水平相對于PA 0.4 mmol·L-1組明顯降低(P<0.05)。

Fig 5 Effect of Cur-NPs on expression of GRP78 and CHOP protein in cardiomyocytes induced by high n=3)

1：Control; 2：PA 0.2 mmol·L-1; 3：PA 0.2 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1; 4：PA 0.4 mmol·L-1; 5：PA 0.4 mmol·L-1+Cur-NPs 200 μmol·L-1.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPA.

3 討論

糖尿病會導(dǎo)致一系列器官或者系統(tǒng)的病理性改變，包括血管、心臟、腎臟、眼睛、足部、神經(jīng)等部位的并發(fā)癥[7]。DCM病理表現(xiàn)為心肌的代謝紊亂、微小血管病變導(dǎo)致的心肌肥大、細胞的壞死與凋亡和間質(zhì)纖維化[8]。DCM會改變心臟正常功能，導(dǎo)致心肌缺血和心力衰竭。持續(xù)高脂的刺激會造成心肌細胞的功能損傷，引起心肌細胞的氧化應(yīng)激和凋亡。PA被廣泛用于細胞或動物實驗中脂毒性損傷模型的建立，在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，PA能誘導(dǎo)心肌細胞、肝細胞、胰島細胞、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞、腎小球足細胞等出現(xiàn)損傷[9]。本研究中，我們采取不同刺激濃度、不同刺激時間來檢測PA對H9c2心肌細胞增殖能力的影響，發(fā)現(xiàn)PA濃度為0.4 mmol·L-1，刺激時間為24 h時細胞增殖率開始出現(xiàn)明顯下降。

姜黃素通過多種途徑保護細胞，能夠減輕細胞的凋亡[10]。但由于姜黃素水溶性低、生物利用度低、血液清除快，使姜黃素在臨床治療中的應(yīng)用受到了限制。納米藥物遞送系統(tǒng)能明顯改善這些缺陷，本研究檢測了Cur-NPs對高脂誘導(dǎo)的心肌細胞損傷的保護作用。MTT結(jié)果顯示，PA 0.4 mmol·L-1刺激細胞24 h后，細胞增殖率明顯下降，給予不同濃度的Cur-NPs預(yù)處理后，細胞的增殖水平逐漸恢復(fù)。根據(jù)MTT實驗結(jié)果，我們選擇200 μmol·L-1為后續(xù)實驗的Cur-NPs給藥濃度。

高脂環(huán)境持續(xù)刺激機體時，機體ROS產(chǎn)生越來越多，且不能及時有效地清除，會使細胞氧化與抗氧化功能打破正常工作狀態(tài)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。本研究中，當(dāng)PA濃度為0.2 mmol·L-1時，與正常對照組相比，細胞ROS明顯增加，而且細胞開始出現(xiàn)凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)改變，當(dāng)PA濃度為0.4 mmol·L-1時，細胞數(shù)量急劇減少，細胞發(fā)生明顯的凋亡。說明長時間暴露于高脂環(huán)境下，可使心肌細胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致細胞的形態(tài)和數(shù)目發(fā)生改變，最終導(dǎo)致心肌細胞出現(xiàn)凋亡，影響心臟的正常功能。同時，我們通過TUNEL檢測試劑盒發(fā)現(xiàn)，隨著PA濃度的增加，H9c2心肌細胞逐漸出現(xiàn)凋亡相關(guān)改變。當(dāng)PA濃度增加為0.4 mmol·L-1時， TUNEL標(biāo)記的紅色熒光明顯增強，同時細胞數(shù)量明顯減少，細胞失去正常形態(tài)，呈現(xiàn)明顯的凋亡相關(guān)形態(tài)學(xué)變化。給予Cur-NPs預(yù)處理后，細胞的氧化損傷和凋亡均出現(xiàn)明顯改善，細胞的數(shù)目和形態(tài)也逐漸恢復(fù)正常。

目前凋亡通路研究較多，細胞內(nèi)氧化應(yīng)激[11]、DNA損傷、鈣離子超負荷等都可以引起細胞色素C和細胞凋亡蛋白酶激活因子1形成了凋亡復(fù)合體，使caspase-3和caspase-9的激活，引起caspase級聯(lián)反應(yīng)[12]。大量結(jié)果表明，Bax和Bcl-2在凋亡通路中有重要作用[13]。本研究證實，H9c2心肌細胞給予0.4 mmol·L-1PA刺激24 h時，細胞內(nèi)caspase-3的水平明顯增高，給予0.2 mmol·L-1PA刺激時，Bax/Bcl-2比值明顯增高；Cur-NPs預(yù)處理后，與PA組相比，PA+Cur-NPs組的caspase-3表達水平及Bax/Bcl-2比值明顯降低，證實Cur-NPs可以明顯降低由高脂誘導(dǎo)的心肌細胞的凋亡水平。進一步觀察了ERS相關(guān)蛋白GRP78和CHOP的表達，發(fā)現(xiàn)高脂環(huán)境下心肌細胞中ERS相關(guān)蛋白表達明顯升高，Cur-NPs預(yù)處理可以明顯降低由高脂引起的ERS蛋白的表達升高。

綜上所述，心肌細胞給予高脂刺激能夠抑制細胞的增殖，并且會導(dǎo)致細胞內(nèi)ROS的增加，激活心肌細胞內(nèi)ERS通路，從而促進細胞凋亡。Cur-NPs可以有效恢復(fù)細胞增殖率，降低氧化損傷，抑制ERS通路的激活，最終減少細胞凋亡，起到保護心肌細胞的作用。說明Cur-NPs能成功逆轉(zhuǎn)高脂誘導(dǎo)的心肌細胞損傷，其作用機制與ERS通路密切相關(guān)。