方 偉，汪電雷，丁 艷，吳青青，吳 潔，姚兆敏

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230031)

海南粗榧內(nèi)酯與海南粗榧內(nèi)酯醇具有的碳骨架相同，如內(nèi)酯環(huán)，但內(nèi)酯醇在結(jié)構(gòu)上多出2個(gè)氫原子[6]。其結(jié)構(gòu)如Fig 1B所示，其分子式為C19H20O4，相對(duì)分子質(zhì)量312.37。目前，國內(nèi)外對(duì)該化合物的研究多集中于化學(xué)合成和藥理活性等方面[7]，作為具有相同碳骨架的生物堿，前期研究表明，海南粗榧內(nèi)酯醇比海南粗榧內(nèi)酯具有更強(qiáng)的藥理活性，但對(duì)其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為尚未見報(bào)道[8]。本文通過建立大鼠血漿中海南粗榧內(nèi)酯醇的測(cè)定方法，考察其在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，旨在為其體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)過程方面提供初步的參考依據(jù)，以期為構(gòu)效關(guān)系以及新藥研發(fā)等方面提供有價(jià)值的依據(jù)。

Fig 1 Chemical structure of hainanolidel(A) and hainanolidol(B)

1 材料與方法

1.1藥品與試劑海南粗榧內(nèi)酯(純度為99.0%)、海南粗榧內(nèi)酯醇(純度為99.0%)，均由昆明植物研究所提供；水為超純水；甲醇(合肥科申化工有限公司)；乙腈(合肥科申化工有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠，♂♀各半，體質(zhì)量(200±25) g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(皖)2017-001，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，可自由飲水。

1.3儀器ACQUITY-CLASS UPLCTM(美國Waters公司)；Vortex-genie渦旋混合器(美國Scientific Industries公司)；Milli-Q超純水器(美國Millipore公司)；Centrifuge臺(tái)式高速離心機(jī)(上海東兢電子有限公司)；BP212D型電子天平(德國Sartorius公司)。

1.4色譜條件菲羅門C18色譜柱100 mm × 2.10 mm，1.7 μm；流動(dòng)相為甲醇-水(47 ∶53)；流速：0.17 mL·min-1；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：326 nm；柱溫：25℃；靈敏度：0.001 AUFS；進(jìn)樣量：3 μL。

1.5標(biāo)準(zhǔn)溶液配制精密稱取海南粗榧內(nèi)酯醇1 mg，加10 mL甲醇配制成標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使之濃度為100 mg·L-1，備用。內(nèi)標(biāo)溶液配制：甲醇溶解海南粗榧內(nèi)酯2.50 mg，使其濃度為25 mg·L-1，備用。

1.6血漿處理取100 μL空白血漿，置于1.5 mL EP管中，精密吸取內(nèi)標(biāo)溶液海南粗榧內(nèi)酯10 μL(25 mg·L-1)，渦旋30 s，再加入200 μL乙腈渦旋振蕩5 min沉淀蛋白，3 000 r·min-1離心10 min；精密吸取上清125 μL，再次12 000 r·min-1離心10 min，取上清于1.5 mL EP管中。

1.7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取上述SPF級(jí)SD大鼠18只，♂♀各半，隨機(jī)分為3組，按1、2、4 mg·kg-1的量經(jīng)尾靜脈注射海南粗榧內(nèi)酯醇(2 mL·kg-1)，在給藥前0 min和給藥后2、5、10、20、30、60、90、120、180、240、300、360 min等不同時(shí)間點(diǎn)眼眥取血0.3 mL，置于經(jīng)肝素處理的EP管中，3 000 r·min-1離心10 min，分離出血漿，按“1.6”項(xiàng)下血漿樣品處理操作，進(jìn)樣分析。

1.8數(shù)據(jù)處理大鼠尾靜脈給藥后，測(cè)得各時(shí)間點(diǎn)的平均血藥濃度(c)-時(shí)間(t)數(shù)據(jù)，代入DAS2.1軟件分析，選擇合適的房室模型，進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的計(jì)算。

2 結(jié)果

2.2定量限的確定取0.1 mL空白血漿，加入0.05 mg·L-1海南粗榧內(nèi)酯醇溶液，按“1.6”項(xiàng)下血漿樣品處理操作，按色譜峰信噪比S/N=10，得定量限為0.05 mg·L-1(準(zhǔn)確度為96.65%，RSD=4.65%，n=5)，按色譜峰信噪比S/N=3作為檢測(cè)限，最低檢測(cè)限為0.01 mg·L-1。

2.3專屬性考察考察了海南粗榧內(nèi)酯醇標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品(2.0 mg·L-1)加內(nèi)標(biāo)海南粗榧內(nèi)酯(2.5 mg·L-1)、單劑量給藥4 mg·kg-1海南粗榧內(nèi)酯醇30 min后大鼠血漿樣品、空白血漿樣品，每組6份。Fig 2為空白血漿、空白血漿中加入海南粗榧內(nèi)酯醇及給藥后大鼠血漿樣品色譜圖，結(jié)果顯示，在按照“1.6”項(xiàng)下血漿樣品處理操作及“1.4”項(xiàng)建立的色譜條件下，海南粗榧內(nèi)酯醇和海南粗榧內(nèi)酯的保留時(shí)間分別為3.95 min、3.05 min左右。結(jié)果表明，在上述建立的色譜條件下，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)海南粗榧內(nèi)酯醇的測(cè)定無干擾。

2.4方法回收率考察分別取不同濃度的海南粗榧內(nèi)酯醇溶液，加入0.1 mL的空白血漿，配制成0.1、1.0、8.0 mg·L-1的低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣品，每個(gè)濃度平行5次，按“1.6”項(xiàng)下血漿樣品處理操作，進(jìn)樣分析得到海南粗榧內(nèi)酯醇峰面積As(H)。另取不同濃度的海南粗榧內(nèi)酯醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋成低、中、高(0.1、1.0、8.0 mg·L-1)3個(gè)濃度的樣品，每個(gè)濃度平行5份，進(jìn)樣分析得到海南粗榧內(nèi)酯醇峰面積As(D)?；厥章?%=As(H)/As(D)平均值×100%，計(jì)算海南粗榧內(nèi)酯醇血漿樣品回收率。經(jīng)計(jì)算，海南粗榧內(nèi)酯醇低、中、高3個(gè)濃度樣品的回收率分別為(89.09±4.5)%、(86.33±4.7)%、(87.27±4.25)%，RSD分別為5.22%、5.61%、4.87%。符合生物樣品分析原則要求的回收率均大于85%。

Fig 2 UPLC chromatograms

A: Blank plasma; B: Blank plasma spiked with hainanolidol(2.0 mg·L-1) and hainanolide(2.5 mg·L-1); C: Plasma sample(30 min) after iv. administration of 4 mL·kg-1hainanolide spiked with hainanolide (2.5 mg·L-1). 1: hainanolide; 2: hainanolidol.

2.5精密度與準(zhǔn)確度取低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控血漿樣品，各濃度平行5份，按“1.6”項(xiàng)下血漿樣品處理方法操作，測(cè)定日內(nèi)精密度。低、中、高日內(nèi)精密度分別為0.086%、0.937%、7.36%，日間精密度分別為0.092%、0.863%、7.32%。并通過線性回歸方程計(jì)算其濃度，與加入濃度進(jìn)行比值計(jì)算，進(jìn)而求得其準(zhǔn)確度。結(jié)果見Tab 1，所有樣品準(zhǔn)確度均在85%～115%范圍內(nèi)，符合生物樣品分析原則要求。

Tab 1 Determination of accuracy and

2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按“1.6”項(xiàng)下血漿樣品處理操作，不同濃度的海南粗榧內(nèi)酯醇溶液中加入0.1 mL的空白血漿，配制成低、中、高(0.1、1.0、8.0 mg·L-1)標(biāo)準(zhǔn)血漿質(zhì)控樣品，各濃度平行5份，進(jìn)行室溫長(zhǎng)期放置，反復(fù)凍融3次和 -20℃冰箱凍存2周的實(shí)驗(yàn)，并通過相應(yīng)的計(jì)算來求算穩(wěn)定性，結(jié)果見Tab 2。

Tab 2 The stability results of hainanolidol during sample storage, preparation and analysis in rat n=5)

2.7大鼠單劑量靜脈注射海南粗榧內(nèi)酯醇的血藥濃度-時(shí)間曲線及主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)大鼠單劑量注射海南粗榧內(nèi)酯醇所得的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見Fig 3。

Fig 3 Mean plasma concentration-time profiles of hainanolidol in rats after iv administration hainanolidol n=6)

將計(jì)算所得的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，采用DAS2.1軟件進(jìn)行擬合(二室模型，權(quán)重系數(shù)為1)，進(jìn)而求算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見Tab 3。低、中、高3個(gè)劑量的血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC0-t與劑量相關(guān)性見Fig 4。

Tab 3 The main pharmacokinetic parameters of hainanolidol after iv administrations in n=6)

Fig 4 The does dependence with single does low, medium and high AUC0-t

3 討論

在色譜分離條件選擇上，因海南粗榧內(nèi)酯醇文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)研究較少，按一般有機(jī)溶劑和色譜柱的考慮因素，分別用甲醇、乙醇、乙腈等溶劑，考察在不同溶劑中的溶解度，發(fā)現(xiàn)海南粗榧內(nèi)酯醇和內(nèi)酯醇在上述3種溶劑中均能完全溶解，從經(jīng)濟(jì)成本上考慮，最終選擇甲醇作為溶劑相[13]。關(guān)于實(shí)驗(yàn)內(nèi)標(biāo)的選取，考慮到海南粗榧內(nèi)酯與內(nèi)酯醇具有相同的碳骨架，是結(jié)構(gòu)相似的同系化合物。紫外全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)海南粗榧內(nèi)酯醇的紫外最大吸收波長(zhǎng)為326、360 nm，其中在326 nm波長(zhǎng)左右海南粗榧內(nèi)酯醇和海南粗榧內(nèi)酯兩種化合物均有較強(qiáng)吸收，同時(shí)考慮到血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)的紫外吸收等因素，綜合選擇326 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。通過流動(dòng)相的優(yōu)化，最終選擇甲醇-水(47 ∶53)作為本實(shí)驗(yàn)色譜檢測(cè)條件，在此條件下，海南粗榧內(nèi)酯醇和海南粗榧內(nèi)酯分別在3.95 min、3.05 min左右出峰，其分離度拖尾因子等方面均符合相關(guān)要求。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥物代謝動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并完成，衷心感謝本研究室全體成員對(duì)本實(shí)驗(yàn)的大力幫助與支持。)