陸春曉，崔 越，何冬旭，馬 鑫

(江南大學(xué)1.藥學(xué)院和醫(yī)學(xué)院，2.國(guó)家重點(diǎn)工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122)

越來(lái)越多研究表明，食用大豆能預(yù)防心血管類疾病以及癌癥的發(fā)生，這主要得益于大豆中的生物活性物質(zhì)，如異黃酮、皂苷、植物甾醇等。其中，大豆皂苷具有防老化、抗氧化、抗凋亡和抗炎的作用[1]。大豆皂苷屬于齊墩果烷三萜類化合物，是兩親性分子。目前，已研究確認(rèn)了18種大豆皂苷，根據(jù)其化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為A類、B類、E類和DDMP類[2]。研究發(fā)現(xiàn)幾種常見(jiàn)的大豆皂苷：Bb、Bc、Ba、βg、βa、Ab、Ac，在大豆中含量較高[3]。近年來(lái)，研究者們也在不斷探索發(fā)現(xiàn)這些常見(jiàn)的大豆皂苷在多種疾病中的重要作用。大量研究表明，大豆皂苷在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，可抑制肺腺癌、淋巴癌、肥大細(xì)胞癌等細(xì)胞系Spc-A-1、YAC-1、P815的DNA合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并且對(duì)人紅白血病細(xì)胞K562和結(jié)腸瘤細(xì)胞HCT-15具有殺傷作用[4]。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象在胚胎形成與器官發(fā)育、組織修復(fù)與器官纖維化以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中均有發(fā)生[5]，涉及Wnt、TGF-β、Notch、PI3K/Akt等多種信號(hào)通路[6]。EMT現(xiàn)象與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和耐藥性密切相關(guān)[7]。有研究表明，Raptor通過(guò)誘發(fā)EMT，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。Jenchlinger等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，MAPK通路的激活在引發(fā)EMT現(xiàn)象的同時(shí)，也增加了多藥耐藥基因2的表達(dá)。本文主要研究了大豆皂苷減弱耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞A2780/PTX的EMT現(xiàn)象，降低細(xì)胞的遷移能力及其耐藥性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑 大豆皂苷購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；N-cadherin、E-cadherin抗體，購(gòu)自Abcam公司；熒光二抗購(gòu)自英濰捷基(上海)股份有限公司；DAPI染料購(gòu)自上海碧云天股份有限公司；Cell Title-Blue@ Cell Viability Assay購(gòu)自Promega公司。

1.1.2儀器 全功能微孔檢測(cè)儀(BioTek公司)；凝膠成像儀(Bio-Rad公司)；激光共聚焦顯微鏡(Leica公司)；正置顯微鏡、倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 耐紫杉醇卵巢癌細(xì)胞A2780/PTX由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)為0.10胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)胞活力檢測(cè) A2780/PTX細(xì)胞分別用DMSO或100 mg·L-1大豆皂苷Bb、Ba、Ab、Ac處理48 h。將處理過(guò)的細(xì)胞以7 000個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，棄原培養(yǎng)基，加入不同濃度(0.01～500 mg·L-1)的紫杉醇處理48 h。每孔加入10 μl Cell Title-Blue溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h后，使用全功能微孔檢測(cè)儀于激發(fā)光560 nm，發(fā)射光590 nm處檢測(cè)熒光值，用GraphPad Prism5軟件計(jì)算IC50值[10]。

1.2.3蛋白免疫印跡 提取A2780/PTX和加100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h后的耐藥細(xì)胞的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用0.05 kg·L-1BSA室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌4次，每次10 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗滌4次，每次10 min，ECL顯色液顯色，通過(guò)凝膠成像儀觀察大豆皂苷Ac處理后，細(xì)胞中N-cadherin、E-cadherin的表達(dá)變化。

1.2.4激光共聚焦檢測(cè) A2780/PTX細(xì)胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h，分別接種適量未處理和處理后的A2780/PTX細(xì)胞于共聚焦小皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)到60%～70%融合時(shí)，加體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌3遍，用體積分?jǐn)?shù)為0.002的Triton X-100通透10 min；PBS洗滌3遍，0.05 kg·L-1BSA封閉30 min；一抗4℃孵育過(guò)夜；PBS洗滌3次，每次10 min，熒光二抗室溫孵育1 h；PBS洗滌3次，每次10 min，DAPI孵育10 min；PBS洗滌3次，每次5 min，使用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)熒光強(qiáng)度。

1.2.5細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) A2780/PTX細(xì)胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h。在24孔板中加入500 μL含體積分?jǐn)?shù)為0.20胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，將Transwell小室(孔徑8 μm)置于24孔板中，接種5×104個(gè)DMEM基本培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞于小室中，培養(yǎng)48 h。棄小室內(nèi)的液體，將小室置于體積分?jǐn)?shù)為0.04的多聚甲醛中固定30 min，PBS洗滌3遍；再用結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3遍。用棉簽擦去小室內(nèi)的細(xì)胞，在顯微鏡下觀察遷移到小室底部的細(xì)胞數(shù)量。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn) A2780/PTX細(xì)胞用100 mg·L-1大豆皂苷Ac處理48 h，接種適量未處理和處理后的細(xì)胞于12孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至90%時(shí)，用槍頭垂直于孔板底部劃一條均勻筆直的劃痕，棄原培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，去除劃痕時(shí)掉落的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。拍取0、24 h時(shí)的照片，觀察細(xì)胞的遷移情況。

2 結(jié)果

2.1不同大豆皂苷對(duì)A2780/PTX耐藥性的影響在A2780/PTX細(xì)胞中分別加入大豆皂苷Bb、Ba、Ab、Ac處理后，與A2780/PTX細(xì)胞同時(shí)測(cè)量耐藥性。Tab 1結(jié)果顯示，加入不同大豆皂苷處理后，A2780/PTX的耐藥性均有減弱的現(xiàn)象，其中加入大豆皂苷Ac處理的效果最明顯，細(xì)胞的IC50值明顯降低。

**P<0.01vsA2780/PTX

2.2大豆皂苷Ac抑制EMTN-cadherin和E-cadherin是EMT的標(biāo)志性蛋白，N-cadherin在耐藥細(xì)胞中高表達(dá)，而E-cadherin在耐藥細(xì)胞中低表達(dá)[11]。因此，本研究檢測(cè)大豆皂苷Ac處理后，A2780/PTX細(xì)胞中N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)情況。蛋白免疫印跡結(jié)果(Fig 1A)和激光共聚焦結(jié)果(Fig 1B)均顯示，經(jīng)大豆皂苷Ac處理后，A2780/PTX細(xì)胞中N-cadherin的表達(dá)降低(P<0.01)，E-cadherin的表達(dá)升高。證明大豆皂苷Ac能夠減弱腫瘤細(xì)胞的EMT現(xiàn)象，降低其耐藥性。

2.3大豆皂苷抑制腫瘤細(xì)胞的遷移能力細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)(Fig 2A)和劃痕實(shí)驗(yàn)(Fig 2B)結(jié)果均顯示，大豆皂苷Ac處理后，遷移的細(xì)胞量減少。證明大豆皂苷Ac能減弱A2780/PTX細(xì)胞的遷移能力。

3 討論

大豆作為現(xiàn)今研究的一個(gè)熱點(diǎn)，已被證實(shí)在腫瘤及多種疾病中發(fā)揮重要作用，其活性物質(zhì)大豆皂苷具有抗氧化、抗凋亡等多種作用[1]。研究表明，大豆皂苷(A1、A2、I)可通過(guò)抑制活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介導(dǎo)的PI3K/Akt/NF-κB途徑的激活來(lái)鈍化炎癥[12]。也可以通過(guò)增強(qiáng)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，減弱H2O2誘導(dǎo)的ROS，從而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13]。Avato等[14]的研究發(fā)現(xiàn)，特定結(jié)構(gòu)類型的皂苷具有作為抗癌劑的潛在可能性，來(lái)自苜蓿屬物種的皂苷可以介導(dǎo)順鉑在腫瘤細(xì)胞中的作用。本文首先挑選了4種在大豆中含量較高的常見(jiàn)大豆皂苷，并從中篩選出了逆轉(zhuǎn)A2780/PTX細(xì)胞耐藥性效果最佳的大豆皂苷Ac。

Fig 1 Soyasaponin Ac affected expression of E-cadherin and N-cadherin of A2780/PTX cells

A2780/PTX cells were treated with 100 mg·L-1of soyasaponin Ac for 48 h, and the expressions of E-cadherin (E-cad) and N-cadherin (N-cad) were detected with Western blot (A) and laser scanning confocal microscopy (B).**P<0.01vsA2780/PTX.

Fig2SoyasaponinAcaffectedmigrationability

A2780/PTX cells were treated with soyasaponin Ac (100 mg·L-1) for 48 h, cell migration was analyzed with transwell (A) and wound healing assay (B).**P<0.01vsA2780/PTX.

EMT是上皮細(xì)胞呈現(xiàn)間充質(zhì)特征的過(guò)程，在細(xì)胞纖維化和癌癥進(jìn)展中起重要作用。 EMT的發(fā)生伴隨著E-cadherin、Laminin-1、Entactin、MUC-1等蛋白的下調(diào)，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin，以及轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Twist、ZEB等的上調(diào)。研究報(bào)道，EMT在卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中起重要作用，EMT由卵巢癌細(xì)胞系中的TGF-β、表皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和內(nèi)皮素1誘導(dǎo)產(chǎn)生。同時(shí)，EMT與卵巢癌化療耐藥之間也存在密切關(guān)系。體外化學(xué)療法可誘導(dǎo)化療耐藥和EMT，并增加卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，靶向抑制或逆轉(zhuǎn)EMT有望成為預(yù)防和治療卵巢癌的良好選擇[5,11]。為探索大豆皂苷Ac逆轉(zhuǎn)A2780/PTX耐藥性的作用機(jī)制，進(jìn)一步檢測(cè)了大豆皂苷Ac處理后細(xì)胞的EMT現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)蛋白免疫印跡和激光共聚焦發(fā)現(xiàn)，大豆皂苷Ac處理后，A2780/PTX細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)降低，E-cadherin表達(dá)升高，EMT現(xiàn)象被抑制。同時(shí)，Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A2780/PTX細(xì)胞的遷移能力也隨之減弱，證實(shí)大豆皂苷Ac可以抑制A2780/PTX細(xì)胞的EMT現(xiàn)象和遷移能力，降低其耐藥性。腫瘤細(xì)胞的耐藥性已成為腫瘤臨床治療的一大難題，大豆皂苷Ac能逆轉(zhuǎn)A2780/PTX細(xì)胞的耐藥性這一發(fā)現(xiàn)，為卵巢癌的治療提供了新的思路和方向。