梁關(guān)鳳，李素娟，邱曉霞，張貴平，羅健東，袁文常，侯 寧

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 511436；2.廣東省第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 廣州 510000；3. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510700)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指因持久而嚴(yán)重的心肌急性缺血、缺氧所引起的部分心肌壞死。AMI后，心肌細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷和喪失，直接導(dǎo)致心臟舒張和收縮功能下降、心室重構(gòu)等。因此，提高AMI心肌細(xì)胞存活率有重要意義。研究表明，Sonic hedgehog(Shh)通路在AMI心肌細(xì)胞中被活化，該通路激活后，心肌細(xì)胞的存活率增加[1]。然而，此通路在急性心梗時對心肌細(xì)胞自身修復(fù)的調(diào)控機(jī)制尚不明確。近年來，DNA損傷在心血管疾病中的作用日益引起關(guān)注，在細(xì)胞進(jìn)行生命活動時，DNA會不可避免地遭受各種內(nèi)源和外源損傷，氧化應(yīng)激、代謝紊亂、缺血缺氧等是其主要的誘發(fā)因素[2]。目前認(rèn)為，細(xì)胞在受到DNA損傷后，會在損傷部位募集DNA損傷反應(yīng)蛋白和DNA修復(fù)相關(guān)蛋白，啟動DNA損傷修復(fù)[3]。

心肌梗死后，血循環(huán)中游離DNA 水平明顯升高[4]。在動脈粥樣硬化病人的斑塊組織內(nèi)，DNA損傷反應(yīng)蛋白-毛細(xì)血管擴(kuò)張癥突復(fù)基因( ataxia telangiectasia mutated gene，ATM) 磷酸化水平升高[5]。在腎臟缺血/再灌注模型中，存在組蛋白(histone，H2AX)、ATM等DNA損傷相關(guān)蛋白磷酸化水平增高[6]。不同形式的DNA 損傷能夠被不同蛋白復(fù)合物識別，通過與磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)家族成員ATM、ATM和Rad3相關(guān)蛋白(ATM and Rad3-related protein，ATR)、DNA依賴性蛋白激酶催化亞單位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)等結(jié)合，啟動 DNA 損傷反應(yīng)及其后續(xù)修復(fù)途徑[7]。那么，在梗死的心肌組織中，心肌細(xì)胞的急性缺血缺氧是否導(dǎo)致DNA損傷的發(fā)生?Shh通路與心肌細(xì)胞的DNA損傷之間又有著怎樣的聯(lián)系?為回答上述問題，本研究建立Sprague Dawley(SD)乳鼠體外心肌缺氧模型，通過檢測 DNA損傷反應(yīng)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)，驗證 DNA損傷是否參與心肌缺氧性損傷；同時應(yīng)用Shh通路的激動劑SAG1.3和抑制劑GANT61來調(diào)控該通路，觀察其對心肌細(xì)胞DNA損傷的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 新生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，購自廣東省實驗動物中心。

1.1.2試劑 DMEM干粉、L-15細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清，購于美國Gibco公司；Shh通路激動劑SAG1.3、抗p-ATM、γH2AX一抗，購自Merck公司；Shh通路抑制劑GANT61購自MCE公司；p-ATR、p53結(jié)合蛋白1(p53-binding protein 1，53BP1)、GAPDH、Bax、Bcl-2、p53、p-p53一抗，購自Cell Signaling Technology公司；Gli1一抗購自R&D公司；Gli2一抗購自Proteintech公司。

1.1.3儀器 低溫高速離心機(jī)(德國Hettich公司)；垂直電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺(蘇州儀器廠)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國UVP)；自動洗片機(jī)(美國Kodak)。

1.2乳鼠心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)新生1～3 d SD大鼠用75%乙醇清潔1～2次，在超凈工作臺無菌條件下，用眼科剪沿左側(cè)肋骨快速打開乳鼠的胸腔暴露搏動心臟，彎鑷取出左心室心肌組織，放入裝有30 mL HBSS離心管中，洗3遍直至洗凈殘留血液。洗干凈的心肌組織移至100 mm培養(yǎng)皿中，修剪后剪碎成0.2 mm的小塊，加入新鮮的8 mL HBSS和2 mL 0.25%的胰酶，4℃冰箱消化13 h。次日，加入2 mL的FBS終止消化后，加入Ⅱ型膠原酶，終濃度為 0.1%，于37℃水浴搖動45 min，取出加入L-15細(xì)胞培養(yǎng)液吹洗10次過濾，于室溫中靜置20 min，離心，加入含10% FBS的DMEM吹打成細(xì)胞懸液，種于100 mm培養(yǎng)皿中，放在正常細(xì)胞培養(yǎng)箱中45 min進(jìn)行差速貼壁。取出培養(yǎng)皿，收集液體離心，棄上清留沉淀，加入含15% FBS的DMEM。在顯微鏡下計數(shù)，接種細(xì)胞，24 h后換液，可見細(xì)胞搏動大于95%即可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3細(xì)胞糖氧剝奪(deprivationofoxygenandglucose,OGD)模型的建立心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)24 h后，換成無EBSS，分別加入Shh信號通路激動劑SAG1.3、抑制劑GANT61，將細(xì)胞放置于37℃無氧(94% N2、5% CO2、1% O2)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，進(jìn)行以下實驗。

1.4實驗分組(1)時間點觀察分為，Control組:空白對照組；OGD組：氧葡萄糖剝奪處理組，細(xì)胞只給予無糖EBSS培養(yǎng)基處理，缺氧培養(yǎng)至預(yù)定時間(3、6、12、24 h)；(2)藥物處理分組:Control組：空白對照組；OGD 6 h、OGD 12 h：氧葡萄糖剝奪處理組，細(xì)胞只給予無糖EBSS培養(yǎng)基處理，缺氧培養(yǎng)至6 h或12 h；OGD 6 h+SAG1.3、OGD 12 h+SAG1.3：氧葡萄糖剝奪處理+SAG1.3組，無糖EBSS培養(yǎng)基處理細(xì)胞，缺氧培養(yǎng)至6 h或12 h；OGD 6 h+GANT61、OGD 12 h+ GANT61：氧葡萄糖剝奪處理+GANT61組，無糖EBSS培養(yǎng)基處理細(xì)胞，缺氧培養(yǎng)至6 h或12 h。

1.5Westernblot檢測取等量的各組蛋白上樣，電泳，分子質(zhì)量低于200 ku的蛋白使用SDS-PAGE凝膠，在100 V恒壓下電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜；分子質(zhì)量大于200 ku的蛋白，使用NuPAGETM3%～8% Tris-Acetate Gel在150 V恒壓電泳1.5 h，30 V恒壓轉(zhuǎn)膜3 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1 h；一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜5次，每次10 min；取出膜，增強(qiáng)化學(xué)熒光發(fā)光試劑中反應(yīng)1 min；曝光成像后進(jìn)行掃描。

1.6細(xì)胞免疫熒光法按照1×108·L-1的密度，將乳鼠心肌細(xì)胞接種到6孔板中(6孔板中預(yù)先在底部放置1片已消毒的玻璃片，并用0.1%明膠預(yù)處理)。處理細(xì)胞后，倒去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定10 min，再用PBS清洗3次，-20℃保存孔板。取出細(xì)胞爬片，裁成1 cm2大小放置在載破片上，滴加新鮮PBS潤洗5 min。將載玻片浸入1% Triton 100中，室溫放置30 min，然后用PBS清洗，5 min×3次；將載玻片浸入100 mmol·L-1甘氨酸，室溫放置20 min，用PBS清洗，5 min×3次；10%山羊血清封閉1 h后，加入一抗，4℃孵育過夜，PBS-T漂洗4次，熒光二抗室溫避光孵育45 min，PBS-T漂洗后，加入DAPI室溫孵育10 min，ddH2O2清洗后封片，熒光顯微鏡下分析樣本，拍照。

1.7MTT法檢測細(xì)胞存活率按照1×104個/孔的密度，將乳鼠心肌細(xì)胞接種到96孔板中，加入含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基，每孔100 μL；于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用PBS清洗細(xì)胞2次，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基換液；加實驗處理因素處理細(xì)胞；每孔加入MTT 50 μL，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h；小心吸出上清液，每孔加入100 μL DMSO，輕輕振蕩15 s，混勻；在酶標(biāo)儀570 nm波長處檢測吸光度值。

2 結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞OGD各時間點Shh通路標(biāo)志蛋白及DNA損傷通路蛋白的表達(dá)Shh通路活化后，其下游蛋白Gli1/2表達(dá)明顯上調(diào)，因此，本實驗以Gli1/2表達(dá)為Shh通路活化的標(biāo)志物。Fig 1A顯示，OGD時Gli1/2表達(dá)隨OGD時間延長逐漸增高，6 h時表達(dá)最高，其后逐步下降。組蛋白H2AX第139位絲氨酸殘基磷酸化形成的γH2AX是DNA損傷檢測的重要標(biāo)志物。如Fig 1B所示，OGD時可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞γH2AX表達(dá)升高，隨OGD時間延長，γH2AX的表達(dá)在6 h時達(dá)到高峰，隨后其表達(dá)逐步降低。DNA損傷反應(yīng)蛋白p-ATM的表達(dá)變化與γH2AX表達(dá)一致；另一DNA損傷反應(yīng)蛋白p-ATR的表達(dá)與γH2AX相反，在心肌細(xì)胞OGD 12、24 h升高。進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)蛋白和凋亡標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，隨著OGD時間延長，心肌細(xì)胞中凋亡標(biāo)志蛋白p53，cleaved-caspase-3表達(dá)逐漸增加，Bcl-2/Bax比例逐漸降低(Fig 1C)。提示OGD誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺血缺氧通過促進(jìn)DNA損傷誘導(dǎo)凋亡。

2.2心肌細(xì)胞OGD各時間點γH2AX的表達(dá)如Fig 2所示，心肌細(xì)胞隨OGD時間延長，核內(nèi)γH2AX表達(dá)逐步增高，γH2AX在OGD 6 h時表達(dá)最高，之后逐步下降，該結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。

2.3OGD6h調(diào)控Shh通路對心肌細(xì)胞DNA雙鏈斷裂(doublestrandbreak，DSB)損傷的影響Fig 3結(jié)果顯示，Shh通路的激動劑SAG1.3、抑制劑GANT61能特異性調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞Gli1/2表達(dá)。OGD 6 h時，心肌細(xì)胞Gli1/2表達(dá)升高，DNA損傷標(biāo)志物γH2AX、損傷反應(yīng)蛋白p-ATM表達(dá)同步升高，另一損傷反應(yīng)蛋白p-ATR未見明顯變化。與OGD組比較，給予Shh通路抑制劑GANT61時，Gli1/2減少，γH2AX、p-ATM表達(dá)增多，p-ATR無明顯變化；給予Shh通路激動劑SAG1.3時，Gli1/2增多，γH2AX、p-ATM表達(dá)減少，p-ATR無明顯變化。

2.4OGD6h調(diào)控Shh通路對DSB損傷的影響Fig 4免疫熒光結(jié)果顯示，OGD 6 h，與OGD組相比，Shh通路抑制劑GANT61誘導(dǎo)γH2AX表達(dá)上調(diào)；Shh通路激動劑SAG1.3明顯抑制γH2AX表達(dá)，該結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。

Fig 1 Expression of Shh pathway proteins (A), DNA damage proteins(B), and apoptotic related proteins(C)

*P<0.05vscontrol

Fig 2 Expression of γH2AX at different time points in neonatal rat cardiomyocytes deprivedof glucose and oxygen detected by immunofluorescence(×400)

Fig 3 Expression of Gli1/2(A) and DNA damage proteins (B) at OGD 6 h detected by Western blot

2.5OGD12h調(diào)控Shh通路對DSB損傷的影響如Fig 5所示，與OGD 6 h的實驗結(jié)果一致，OGD 12 h給予Shh通路抑制劑GANT61后，Gli1/2減少，γH2AX、p-ATM表達(dá)增多，p-ATR略有升高；給予Shh通路激動劑SAG1.3時，Gli1/2增多, γH2AX、p-ATM表達(dá)減少，p-ATR表達(dá)經(jīng)與ATR條帶灰度值比較，未見明顯變化。

2.6OGD12h調(diào)控Shh通路對DSB損傷的影響Fig 6免疫熒光結(jié)果顯示，OGD 12 h時，與OGD組相比，Shh通路抑制劑GANT61誘導(dǎo)γH2AX表達(dá)增多；Shh通路激動劑SAG1.3明顯抑制γH2AX表達(dá)。該結(jié)果與Western blot結(jié)果一致。

2.7OGD6、12h調(diào)控Shh通路對心肌細(xì)胞凋亡的影響Tab 1、Fig 7結(jié)果顯示，給予Shh激動劑SAG1.3處理后，OGD 6、12 h時，心肌細(xì)胞的存活 率均明顯提高，細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白p-p53、cleaved-caspase-3表達(dá)減少、Bcl-2/Bax比值增高，細(xì)胞凋亡減少。與之相反，經(jīng)Shh抑制劑GANT61處理的心肌細(xì)胞，OGD 6、12 h細(xì)胞存活率降低，p-p53、cleaved-caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值降低，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增多。

Group6 h12 hControl0.569±0.1400.569±0.150OGD0.294±0.058**0.336±0.025**OGD+GANT610.231±0.021#0.247±0.012#OGD+SAG1.30.306±0.042#0.352±0.036#

**P<0.01vscontrol；#P<0.05vsOGD

Fig 4 Expression of γH2AX when Shh pathway was regulated at OGD 6 h detected by immunofluorescence(×400)

Fig 5 Expression of Gli1/2 (A) and DNA damage proteins (B) at OGD 12 h detected by Western blot

3 討論

AMI是威脅人類健康的常見心血管疾病之一，研究AMI后心臟功能改善和心肌修復(fù)的具體機(jī)制對臨床治療具有重要的現(xiàn)實意義。Shh是Hedgehog家族中分布最廣、研究最多、功能最重要的一類蛋白。大量研究表明，分子質(zhì)量為19 ku 的Shh與其受體Ptch1結(jié)合，促進(jìn)核轉(zhuǎn)錄因子 Gli1、Gli2入核，激活Hedgehog信號通路，通過促進(jìn)細(xì)胞的增殖、干細(xì)胞的存活、血管生成等，對胰腺、骨髓、心血管系統(tǒng)等組織損傷的修復(fù)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]。大量研究表明，AMI心臟中Shh信號通路是被激活的，該通路活化后可促進(jìn)心肌梗死區(qū)域及梗死周邊區(qū)域毛細(xì)血管新生，改善心臟功能，縮小梗死面積。但其對心肌細(xì)胞自身修復(fù)能力的調(diào)控作用及機(jī)制尚不完全清楚。

研究發(fā)現(xiàn)，多種因素導(dǎo)致的DNA損傷中，γH2AX即組蛋白H2AX第139位絲氨酸磷酸化蛋白表達(dá)均增高；在DNA損傷修復(fù)反應(yīng)早期，H2AX的磷酸化是最早發(fā)生的分子事件之一，因此，γH2AX已經(jīng)被廣泛認(rèn)定為DNA損傷的分子標(biāo)志物。γH2AX可作為起始信號分子，將下游相關(guān)蛋白募集到損傷位點，進(jìn)而啟動細(xì)胞的周期阻滯、修復(fù)、凋亡等[9]。H2AX的磷酸化主要受到PI3K家族成員ATM、ATR、DNA-PKcs等蛋白的催化調(diào)控。大量研究發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境因素誘導(dǎo)的DNA損傷通過活化不同的PI3K成員，誘導(dǎo)H2AX磷酸化，從而啟動DNA損傷修復(fù)應(yīng)答系統(tǒng)。由DNA復(fù)制差的壓力應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的H2AX磷酸化主要依靠ATR催化，與ATM、DNA-Pks無關(guān)；而在電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)，γH2AX表達(dá)主要是由p-ATM的自磷酸化催化[10]。我們前期在研究氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞DNA損傷時也發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的H2AX磷酸化以及γH2AX簇集點的形成主要是通過ATM的磷酸化完成的[11]。

Fig 6 Immunofluorescence detected the expression of γH2AX when Shh pathway was regulated at OGD 12 h(×400)

Fig 7 The expression of apoptotic proteins and the cardiomyocytes survival rate whenregulate the Shh pathway at OGD 6 h (A) and OGD 12 h

本研究以原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞建立OGD的體外缺血缺氧模型，通過Western blot檢測DNA損傷標(biāo)志性蛋白γH2AX，以及DNA損傷的關(guān)鍵應(yīng)答蛋白ATM、ATR的表達(dá)。結(jié)果顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞缺氧時，γH2AX表達(dá)明顯增高，在OGD 6 h時表達(dá)達(dá)高峰，此時較多的心肌細(xì)胞已經(jīng)出現(xiàn)較大損傷，隨后γH2AX的表達(dá)逐步下降，心肌細(xì)胞凋亡增加。ATM磷酸化表達(dá)趨勢與γH2AX一致，說明缺血缺氧可通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ATM磷酸化，促進(jìn)H2AX磷酸化，隨后啟動DNA損傷修復(fù)反應(yīng)。

本項目組前期的體內(nèi)外研究中已經(jīng)明確，Shh通路活化在心肌梗死、氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡、自噬中發(fā)揮重要保護(hù)作用[12-13]。已有的研究顯示，活化的Shh對離子輻射造成的人肝癌細(xì)胞DSB具有保護(hù)作用[14]；抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞Gli表達(dá)，可直接激活DSB反應(yīng)激酶，誘導(dǎo)核內(nèi)γ-H2AX表達(dá)增多，活化凋亡誘導(dǎo)蛋白，導(dǎo)致癌細(xì)胞廣泛凋亡[15]。但是，目前該通路對心肌DNA損傷的調(diào)控關(guān)系尚不清楚。本研究進(jìn)一步探討Shh通路與缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞DNA損傷的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示，在OGD后，心肌細(xì)胞Gli1/2表達(dá)上調(diào)，Shh通路被激活；Gli1/2在OGD 6 h也出現(xiàn)與γH2AX一致的表達(dá)高峰，提示Shh信號通路可能參與心肌細(xì)胞DNA損傷的應(yīng)答過程。隨后分別使用Shh通路激動劑SAG1.3、抑制劑GANT61調(diào)控心肌細(xì)胞Shh通路的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)給予Shh通路激動劑SAG1.3時，γH2AX、p-ATM表達(dá)明顯減少，細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)減少，細(xì)胞生存率提高；而抑制劑GANT61則加重DNA損傷，γH2AX、p-ATM表達(dá)明顯增加，細(xì)胞凋亡標(biāo)志物表達(dá)增多。由此可見，Shh信號通路可通過抑制p-ATM/γH2AX通路，減輕DNA損傷，從而在缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要保護(hù)作用。但Shh通路如何影響ATM的磷酸化水平，其具體的調(diào)控機(jī)制尚需深入探討。本研究首次在體外研究中證實Shh通路與心肌細(xì)胞DNA損傷的關(guān)系，后續(xù)將在心肌梗死動物模型中深入研究Shh通路對心肌DNA損傷和修復(fù)的調(diào)控作用及機(jī)制。

綜上所述， Shh通路活化可通過影響DNA損傷修復(fù)通路，抑制心肌缺血缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，本研究為改善AMI細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌修復(fù)提供新的線索和思路。

(致謝：本實驗在廣州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心、藥理實驗室及基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心機(jī)能實驗室完成，在此對實驗過程中給予指導(dǎo)和幫助的老師表示感謝!)