李 根，趙 棟，李 健，3，尹秀山，4,張萬(wàn)忠

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110142；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所，陜西 西安 710021;3.肯塔基大學(xué)藥學(xué)院，美國(guó) 列克星敦 40536;4.卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院微生物，腫瘤與細(xì)胞研究所，瑞典 斯德哥爾摩 17165)

端錨聚合酶(tankyrase，TNKS)，包括TNKS1和TNKS2，屬于聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[也稱作ADPribosyltransferase，ARTDs或poly(ADPribose)polymerases，PARPs]家族，人源PARP家族包括17個(gè)成員[1]。該家族具有1個(gè)共有的催化結(jié)構(gòu)域——PARP，其催化底物NAD+的ADP-核糖單位，將之加入到靶蛋白的谷氨酸或賴氨酸殘基上。該家族成員PARP1研究的比較深入。PARP1參與多種細(xì)胞進(jìn)程，包括DNA修復(fù)、復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。PARP1可感應(yīng)DNA損傷，并形成單鏈缺口(single-strandbreaks，SSB)，可以作為DNA修復(fù)的橋梁發(fā)揮作用，因此與多種腫瘤密切相關(guān)[2]。針對(duì)PARP1的多個(gè)小分子抑制劑被研發(fā)并進(jìn)入臨床Ⅲ期試驗(yàn)，如維利帕尼、BMN-673，以及臨床前期的候選藥物如E7016、NMS-P118[3]。這些藥物的初步成功證明了藥物靶向TNKS的潛力。近年來(lái)，更多研究集中于各個(gè)PARP家族成員的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，以及高度選擇性小分子抑制劑的設(shè)計(jì)。TNKS作為有潛力的藥物靶點(diǎn)，成為靶向研究的重點(diǎn)。本文總結(jié)了TNKS作為藥物靶點(diǎn)的分子基礎(chǔ)和TNKS抑制劑開(kāi)發(fā)領(lǐng)域的最新進(jìn)展，并展望了TNKS作為藥物研發(fā)靶點(diǎn)的前景。

1 TNKS的結(jié)構(gòu)

TNKS1(tankyrase1/ARTD5/PARP5a)和TNKS2(tankyr-ase2/ARTD6/PARP5b)與該家族其它成員相比，含有2個(gè)獨(dú)特的結(jié)構(gòu)域：介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用的錨蛋白重復(fù)序列簇(ANK, ARCs)和形成同源或異源多聚體的SAM結(jié)構(gòu)域(Fig 1A)。兩種酶蛋白序列高度保守，同源性高達(dá)80%。位于蛋白的C端的催化結(jié)構(gòu)域在兩者之間的序列同源性達(dá)89%。4個(gè)ARC都具有1段保守序列RXXPDG，該序列介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用[4]。由SAM區(qū)域介導(dǎo)的TNKS多聚化可被自體聚ADP-核糖基化而阻斷，這使得TNKS成為一類可根據(jù)PARs水平而組裝或者分解的一類蛋白質(zhì)[5]。催化結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)：結(jié)合并水解NAD+的供體位點(diǎn)和容納準(zhǔn)備修飾聚ADP-核糖基化靶蛋白的受體位點(diǎn)。其中，供體位點(diǎn)分為結(jié)合在煙酰胺部分和腺苷酸部分的亞結(jié)合位點(diǎn)[6]。在TNKS1中，D環(huán)通過(guò)疏水作用關(guān)閉在煙酰胺位點(diǎn)附近的結(jié)合槽；而在TNKS2中，主要通過(guò)His1048關(guān)閉在腺苷酸位點(diǎn)附近的結(jié)合槽。當(dāng)NAD+與位點(diǎn)結(jié)合或者有抑制劑存在時(shí)，D環(huán)會(huì)打開(kāi)[7]。盡管D環(huán)在TNKS1和2的氨基酸序列是相同，但是兩者構(gòu)型并不相同(Fig 1D、1E)。

2 TNKS的生物學(xué)功能

TNKS分布在細(xì)胞的多個(gè)亞器官。在人類細(xì)胞中，TNKS在端粒、核孔、高爾基復(fù)合體、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜等都有發(fā)現(xiàn)。與其廣泛分布相對(duì)應(yīng)，TNKS在細(xì)胞水平參與多種調(diào)控，例如端粒的穩(wěn)態(tài)平衡、有絲分裂、Wnt信號(hào)通路、葡萄糖吸收(Fig 2)[8-9]。特別是對(duì)Wnt信號(hào)通路的作用，多種疾病中發(fā)生Wnt信號(hào)通路的過(guò)度激活[10]，Wnt通路參與炎癥方面的機(jī)制逐漸被證實(shí)[11]。目前的模型預(yù)測(cè)，在存在功能性降解復(fù)合物的情況下，TNKS通過(guò)增加Axin的降解，降低了降解復(fù)合物的穩(wěn)定性，這導(dǎo)致β-catenin降解減少，從而增加Wnt信號(hào)的水平。通過(guò)小分子抑制TNKS的催化活性，可穩(wěn)定Axin，進(jìn)而調(diào)控Wnt通路。靶向Wnt信號(hào)通路是晚期直結(jié)腸癌Wnt依賴性治療APC突變的一個(gè)非常有吸引力的策略，因此，TNKS有希望成為調(diào)控直結(jié)腸癌中Wnt通路的治療靶點(diǎn)。雖然TNKS1和TNKS2具有功能冗余性，但其亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的差異可能導(dǎo)致兩者具有獨(dú)特的功能。該方面尚待進(jìn)一步的研究。

3 TNKS抑制劑

像其他PARPs一樣，TNKS抑制劑靶向于催化結(jié)構(gòu)域。利用Wnt通路的熒光素酶報(bào)告基因篩選發(fā)現(xiàn)了第1種TNKS酶選擇性抑制劑IWR-1和XAV939[12]。基于同樣的篩選，也發(fā)現(xiàn)了TNKS特異性抑制劑WIKI4、JW55、JW74及其衍生物G007-LK等[13]。生物化學(xué)方法與基于片段的配體設(shè)計(jì)的結(jié)合最近被用于篩選和表征化合物來(lái)抑制TNKS，例如新型抑制劑E7449能夠同時(shí)抑制PARP1/2和TNKS1/2，在BRCA缺陷的體內(nèi)模型中顯示出有效的抗腫瘤活性，并增加臨床前化療的效果。E7449對(duì)TNKS1/2的抑制與傳統(tǒng)的抑制劑有明顯區(qū)別，其可以擴(kuò)大缺乏DNA修復(fù)能力的腫瘤以外的潛在治療應(yīng)用。通過(guò)對(duì)Wnt通路抑制劑的深入研究，可能會(huì)發(fā)現(xiàn)一些Wnt通路和TNKS的雙重抑制劑。Gustafson等[14]最新的研究結(jié)果表明，Wnt通路抑制劑FH535使Axin2的PARs修飾減少，表明其同樣可以阻斷TNKS1/2酶活性，其可以作為控制骨肉瘤的有效化療抑制劑。隨著TNKS作為藥物靶點(diǎn)對(duì)許多疾病(包括選定的腫瘤細(xì)胞)所展示出的良好效果，針對(duì)TNKS新型高效的抑制劑相繼被研發(fā)出來(lái)，在以下部分中，我們將根據(jù)TNKS抑制劑的作用位點(diǎn)及作用方式，對(duì)各種抑制劑進(jìn)行總結(jié)。

Fig 1 Structure of TNKS

A: The domain schematic of anthropogenic protein TNKS; B, C: The crystal structure overlay of TNKS1, TNKS2 and PARP1(TNKS1 identified as green, TNKS2 identified as cyan, PARP1 identified as purple, and C is the conformation of B rotated 90°; D,E: The crystal structure of D-loop(TNKS1 identified as purple, TNKS2 identified as yellow, E is the enlarged crystal structure of TNKS2 D-loop).

A: TNKS interacts with TRF1 to maintain telomere homeostasis; B: TNKS modified NUMA at mitosis to regulate spindle assembly and chromatin separation; C: TNKS binds to IRAP and promotes exocytosis of GSVs, catalyzing transmembrane entry of glucose into cells; D: TNKS increases degradation of Axin to reduce stability of degradation complex, thereby increasing level of Wnt signaling.

煙酰胺亞位點(diǎn)在人類PARP家族的成員中保守，許多TNKS抑制劑通過(guò)該位點(diǎn)與TNKS結(jié)合。XAV939最初是作為PARP1/2抑制劑開(kāi)發(fā)的，其IC50值較弱(對(duì)于PARP1和PARP2，分別為2.2 mmol·L-1和0.11 mmol·L-1)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，XAV939是TNKS1和TNKS2的更有效的抑制劑(IC50分別為11 nmol·L-1和4 nmol·L-1)[15]。使用XAV939作為先導(dǎo)化合物，Ma等[16]合成了一種名為WXL-8的氨基取代衍生物。通過(guò)TNKS1比色酶活性實(shí)驗(yàn)，WXL-8表現(xiàn)更有效的TNKS1抑制作用(IC50為9.1nmol·L-1)。WXL-8在HepG2、Huh7、Hep40細(xì)胞中抑制細(xì)胞增殖和集落形成，通過(guò)穩(wěn)定Axin1和Axin2，降低β-catenin蛋白水平。煙酰胺位點(diǎn)抑制劑通常含有煙酰胺模擬物，其將抑制劑錨定在口袋的底部。模擬煙酰胺的小抑制劑，TIQ-A和菲啶酮的TNKS2的IC50分別為24 nmol·L-1和14 nmol·L-1，PARP1的IC50分別為450 nmol·L-1和300 nmol·L-1，顯示出較好的選擇性[17]。TIQ-A和菲啶酮的結(jié)構(gòu)非常相似，與TNKS形成的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)之間沒(méi)有明顯差異。因此，所測(cè)量的IC50值的差異可能是由于六元環(huán)菲啶酮更有效的疏水相互作用所引起的。Jeffrey等[18]從2-芳基喹唑啉-4-酮化合物開(kāi)始，發(fā)現(xiàn)了吡咯并嘧啶酮化合物AZ6102(4)(Fig 3)。它是一種高效的TNKS1/2抑制劑，選擇性是其它PARP家族酶的100倍，在DLD-1細(xì)胞中顯示5 nmol·L-1的劑量對(duì)Wnt通路有明顯抑制作用。此外，AZ6102可以在20 mg·L-1靜脈溶液中溶解，并在臨床前物種中表現(xiàn)出良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。Larsson等[19]通過(guò)基于片段的配體設(shè)計(jì)(fragment-based ligand design，F(xiàn)BLD)發(fā)現(xiàn)了一系列TNKS2的選擇性抑制劑，例如7-(2-氟苯基)-4-甲基喹啉-2(1H)-酮等。通過(guò)熱轉(zhuǎn)移測(cè)定發(fā)現(xiàn)的片段靶具有更好的擴(kuò)展幾何矢量，結(jié)合模式和XAV939的重疊較少，可以提供更多新穎的化合物。FBLD策略確定了配體結(jié)合蛋白中的熱點(diǎn)和核心片段。與現(xiàn)有化合物相比，該策略可以產(chǎn)生更有效結(jié)合的先導(dǎo)化合物以及新穎的結(jié)構(gòu)框架。吡喃并吡啶酮型抑制劑在各種基于細(xì)胞的測(cè)定中顯示出較高活性，de Vicente等[20]使用基于片段/結(jié)構(gòu)優(yōu)化策略，發(fā)現(xiàn)具有良好吡喃并吡啶酮性能的抑制劑8(Fig 4)。抑制劑8具有適中的全身清除率(28 mg·kg-1·min-1)和分布體積，可被迅速、廣泛地吸收。在5mg·kg-1劑量下口服，生物利用度高(49%)，以50 mg·kg-1劑量服用時(shí)，生物利用度增加至92%。鑒于吡喃并吡啶酮型抑制劑的前景較好，該類抑制劑可用來(lái)進(jìn)行深入的優(yōu)化和研究。這些小型分子抑制劑結(jié)合到PARPs的催化區(qū)域，與煙酰胺的結(jié)合位點(diǎn)很好地重疊，并顯示低納摩爾效力。與其他結(jié)構(gòu)特異性的PARP相比，TNKSs中的煙酰胺亞位點(diǎn)更具有限制性和疏水性。該位點(diǎn)的疏水性主要是由于位于F環(huán)的Pro1034、Phe1035和位于G環(huán)的Ile1075。優(yōu)化后的小分子對(duì)TNKS酶具有高選擇性，在體外和體內(nèi)都具有良好的生物利用度和適度的清除率。

Fig 3 Discovery of AZ6102

Fig 4 Design and optimization of pyridopyridone inhibitor 8

IWR-1(9)結(jié)合到TNKS酶的腺苷亞位點(diǎn)，并引起D環(huán)的打開(kāi)。它的降冰片烯部分結(jié)合到活性位點(diǎn)的3個(gè)Tyr之間，腺苷部分結(jié)合在活性位點(diǎn)α螺旋和D環(huán)的1個(gè)組氨酸之間[21]。在IWR-1基礎(chǔ)上，Bregman等[22]基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，發(fā)現(xiàn)具有高度改善效力和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的化合物12(Fig 5)。二取代的苯并咪唑與IWR1相比，細(xì)胞效能明顯改善。Huang等[23]在優(yōu)化上述化合物10期間，通過(guò)高通量篩選鑒定化合物13為有效新型TNKS抑制劑。上述兩種化合物(10，13)與TNKS1結(jié)合的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)的重疊啟發(fā)了一個(gè)假設(shè)，即用2-氨基吡啶代替化合物13的不穩(wěn)定氨基喹唑啉酰胺(14)可能提高抑制劑在血漿中的穩(wěn)定性，同時(shí)保持與靶蛋白的2個(gè)關(guān)鍵的氫鍵相互作用(Fig 6)。利用高通量篩選，James等[24]發(fā)現(xiàn)了新型TNKS抑制劑WIKI4，在所測(cè)試的細(xì)胞系中，WIKI4均表現(xiàn)出對(duì)Wnt信號(hào)通路的抑制，包括A375、DLD1結(jié)腸直腸癌細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞。WIKI4對(duì)TNKS1/2的IC50值均處于低納摩爾范圍(TNKS1約26 nmol·L-1，TNKS2約15 nmol·L-1)。WIKI4結(jié)合模式的結(jié)構(gòu)特征有助于以其作為骨架開(kāi)發(fā)代謝穩(wěn)定性，藥代動(dòng)力學(xué)更優(yōu)良的新型抑制劑。在人結(jié)腸直腸癌細(xì)胞中， JW74迅速抑制活性β-catenin，下調(diào)Wnt靶基因，包括Axin、SP5。JW74衍生物G007-LK是一種有效的TNKS抑制劑，其優(yōu)于多種其他同工酶的選擇性，對(duì)測(cè)試的激酶、磷酸酶和GPCRs沒(méi)有抑制作用，并且在體外具有良好的活性[25]。G007-LK在Ⅰ期臨床試驗(yàn)中代謝穩(wěn)定，并且顯示出優(yōu)異的藥代動(dòng)力學(xué)特征。最近，Okada-Iwasaki等[26]使用轉(zhuǎn)錄報(bào)告基因系統(tǒng)在突變型結(jié)腸癌DLD-1細(xì)胞中進(jìn)行高通量篩選，發(fā)現(xiàn)了選擇性Wnt通路抑制劑K-756。K-756通過(guò)抑制Wnt /β-catenin途徑，抑制APC突變型結(jié)腸直腸癌COLO 320DM和SW403細(xì)胞的生長(zhǎng)。雖然ARTD1/2抑制劑在BRCA突變的治療中被證明是有效的，其副作用如誘發(fā)基因組不穩(wěn)定性可能是潛在隱患。因此，與較少選擇性的TNKS抑制劑如XAV939相比，K-756可能是抗腫瘤治療藥物開(kāi)發(fā)的更好候選者?？煽诜o藥的選擇性化合物K-756可以作為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)更有效的衍生物的先導(dǎo)化合物。盡管與腺苷亞位點(diǎn)結(jié)合的化合物發(fā)現(xiàn)方法不同，它們都具有2個(gè)保守的氫鍵受體，與D環(huán)的組氨酸和各種疏水區(qū)的π-π堆積。通常在TNKS選擇性腺苷位點(diǎn)和煙酰胺位點(diǎn)結(jié)合物之間共享1或2個(gè)疏水作用。到目前為止，僅與腺苷亞位點(diǎn)結(jié)合的抑制劑沒(méi)有被證實(shí)可作用于其他PARPs，提示這些化合物的高度選擇性。

Fig 5 Design and optimization of oxazolidinone inhibitor 12

煙酰胺亞位點(diǎn)與腺苷亞位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)，促進(jìn)了研究者去設(shè)計(jì)同時(shí)阻斷這2個(gè)位點(diǎn)的抑制劑。EB-47被證實(shí)是雙位點(diǎn)抑制劑[17]，作為NAD+模擬物，EB-47的結(jié)合類似于NAD+的結(jié)合。在TNKS2中，它在煙酰胺亞位點(diǎn)處發(fā)生常規(guī)的相互作用。在腺苷亞位點(diǎn)，化合物的核糖羥基與His1031和Ser1033(它們?cè)赑ARP家族中保守，但不被其他抑制劑所利用)相互作用(Fig 7)。使用以IWR-2藥效基團(tuán)為基礎(chǔ)的亞結(jié)構(gòu)檢索模型，Bregman等[27]確定了1種對(duì)TNKS1具有低納摩爾效力的長(zhǎng)喹唑啉酮化合物?；衔镌诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)中具有比IWR-1和XAV939更強(qiáng)的Wnt通路抑制作用(TNKS1 IC50:0.008 μmol·L-1，TNKS2：0.002 μmol·L-1)。近期，諾華公司發(fā)布的雙位點(diǎn)抑制劑NVP-TNKS656在小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)果，顯示具有良好的藥動(dòng)學(xué)特性、生物利用度和改善的選擇性(TNKS2特異性抑制劑)[28]，使其成為化學(xué)骨架良好的候選者。

Fig 6 Design and optimization of oxazolidinone type 14

Fig 7 The chemical structure of EB-47(A) and crystal structure

4 展望

TNKS是富有挑戰(zhàn)性的藥物靶點(diǎn)，它們?cè)趥€(gè)體細(xì)胞、健康或疾病中發(fā)揮的功能還需要更加深入的理解。TNKS抑制劑是一個(gè)相對(duì)較新的研究領(lǐng)域，這個(gè)未知的領(lǐng)域?qū)τ谒幬锇l(fā)現(xiàn)研究人員來(lái)說(shuō)有很大的潛力。選擇性是闡明TNKS酶在開(kāi)發(fā)下一代TNKS抑制劑作為治療劑發(fā)揮功能的重要方面。隨著TNKS抑制劑的分子機(jī)制和結(jié)合模式的日益了解，將推動(dòng)下一代針對(duì)PARPs家族成員量身定制的多靶點(diǎn)活性的先導(dǎo)化合物的設(shè)計(jì)。例如了解特定的TNKS-TNKS抑制劑相互作用的詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息、結(jié)合口袋周圍的化學(xué)空間，以及具有能量可接近的幾何形狀的整體形狀，有助于發(fā)現(xiàn)更精細(xì)的、更高效力和改善的選擇性下一代TNKS抑制劑。多學(xué)科的協(xié)調(diào)能更好地幫助優(yōu)化先導(dǎo)化合物。此外，多樣性定向合成(DOS)、動(dòng)態(tài)組合化學(xué)(DCC)和HTS技術(shù)(例如微陣列)的結(jié)合，可以用于探索與生物相關(guān)的化學(xué)空間的TNKS，并進(jìn)一步徹底改變先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化步驟。目前，所有TNKS抑制劑靶向供體NAD+結(jié)合位點(diǎn)，另外兩種可藥用的位點(diǎn)存在于受體位點(diǎn)和錨蛋白重復(fù)序列。在使用自動(dòng)修飾作為信號(hào)的體外酶活性篩選中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)錨蛋白重復(fù)抑制劑，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用目前也較難以用抑制劑靶向。然而，錨蛋白重復(fù)序列和受體位點(diǎn)提供用于選擇性靶向TNKS酶的新的場(chǎng)所，因?yàn)殄^定蛋白重復(fù)不存在于其它PARP中，大大提高了抑制劑的選擇特性。另外，TNKS的抑制似乎具有強(qiáng)烈的微環(huán)境依賴性，TNKS抑制的生物學(xué)結(jié)果將受其他細(xì)胞途徑活性影響，例如細(xì)胞NAD+水平、缺氧條件和其他代謝改變。TNKS和PARP1/2雙重抑制劑仍然是新型抗癌藥物開(kāi)發(fā)的新策略。抑制TNKS似乎在治療上很有吸引力，但仍需要藥理學(xué)改進(jìn)的化合物或與其他療法的組合以發(fā)揮抗癌作用。因此，TNKS抑制劑可能需與其他的細(xì)胞途徑抑制劑合用來(lái)提高治療效果。特別是在癌癥背景下，幾種PARP酶的抑制劑雞尾酒療法可能是更有效的策略。此外，與其他PARP同工酶選擇性抑制劑聯(lián)用也是未來(lái)的探索方向。開(kāi)發(fā)更有效和更具特異性的TNKS酶抑制劑不僅能夠使我們進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)TNKS的功能，更重要的是推動(dòng)腫瘤治療相關(guān)的臨床研究。