岳鈴鐘秀瓊楊粘黃耿耿

（1，貴州省貴陽市白云區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 550014；2，云南省楚雄州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 675000；3，貴州省貴陽市白云區(qū)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所 550014）

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種急性或慢性、熱性和高度接觸性傳染病。豬瘟呈世界性分布，其危害程度高，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失巨大，一直是國(guó)際重點(diǎn)檢疫對(duì)象，盡管我國(guó)兔化弱毒疫苗為控制豬瘟起到巨大作用，但豬瘟仍在我國(guó)流行嚴(yán)重。豬瘟E2蛋白一直是豬瘟研究的熱點(diǎn)。單克隆抗體以其高度的特異性和敏感性而在CSFV生物學(xué)研究中起重要作用。為進(jìn)一步探索基因疫苗制備單克隆抗體的新方法，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了CSFV E2基因真核表達(dá)質(zhì)，并用其免疫Balb/C小鼠，用原核表達(dá)的CSFV E2抗原作為檢測(cè)抗原篩選，建立了2株雜交瘤細(xì)胞株，這2株單克隆抗體與CSFV能特異性反應(yīng)并具有中和能力。這是利用基因免疫制備動(dòng)物病毒單克隆抗體的首次報(bào)道，為廣泛利用這一技術(shù)研制單克隆抗體打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌種與質(zhì)粒、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

大腸桿菌JM101、JM109、和 BL21(DE3)plysS、 DH5α、BL21(DE3)plysS宿主菌、質(zhì)粒pET-28a（+）和pVAX1由本室保存由本實(shí)驗(yàn)室保存。PK-15、SP2/0細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。Balb/c小鼠購(gòu)買于昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。豬瘟病毒石門株全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)蛋白基因以ppocsfv.dna由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)余興龍教授饋贈(zèng)。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨（TRYPTONE）、鄰苯二胺（OPD）、30%雙氧水（H2O2）、牛血清白蛋白（BSA）、Tween-20、瓊脂糖、oligo（dT）、dNTP（上海生物工程有限公司）；新生牛血清、胎生牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、PRMI-1640培養(yǎng)基（GIBOCO）；HRP標(biāo)記的兔抗鼠IgG。

2 方法

2.1 豬瘟病毒E2基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)Genbank登錄的豬瘟病毒石門株E2基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增E2全長(zhǎng)基因的上游引物E2Fp GGATCCACCATGGTATTAAGGGGACAGATCGTGC和下游引物E2RP CGGAATTCCTAGTCAAACCGGTACTGATACTCACC。PCR循環(huán)參數(shù)為95℃變性5min,95℃ 50s,55℃ 50s,72℃ 20s，25個(gè)循環(huán)。用Agarose Gel Extraction Kit(B.M)分別回收PCR產(chǎn)物，然后用BamHI和 EcoRI雙酶切 PCR產(chǎn)物并回收酶切產(chǎn)物，然后連接到pVAX1的BamHI和EcoRI兩位點(diǎn)之間。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5αE.coli。從轉(zhuǎn)化平板上挑取單個(gè)菌落接種到3ml含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h后小量提取質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用BamHI EcoRI雙酶切，切出目的片段即為陽性重組子，送樣測(cè)定序列。

2.2 豬瘟病毒E2基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

將編碼豬瘟病毒囊膜糖蛋白E2基因的表達(dá)載體質(zhì)粒pET-28a-E2，轉(zhuǎn)入受體菌BL21（DE3）plysS中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)了具有抗原性的E2蛋白。包涵體提取后用20mM的Tris-HCl（pH8.0）懸浮，與4倍SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸10～15min待包涵體徹底溶解后，進(jìn)行PAGE電泳，檢測(cè)含量和純度。

2.3 動(dòng)物免疫

選擇8～12周齡Balb/c小鼠6只，每只小鼠后肢脛前肌注射脂質(zhì)體包被的基因疫苗pVAXE2，注射劑量每只小鼠注射含20μg共100μl的基因疫苗，共注射6只小鼠，免疫5次，每次間隔兩周，每次免疫同樣劑量的細(xì)胞，融合前一周再加強(qiáng)免疫一次。

2.4 基因免疫小鼠的血清抗體檢測(cè)

免疫2次和3次后5d，從小鼠尾部采血，1：200倍稀釋，用重組純化的E2蛋白（每孔包被量為40μg）為檢測(cè)抗原，以牛血清白蛋白為封閉劑，間接ELISA檢測(cè)基因免疫小鼠血清抗體水平。

2.5 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

取健康小鼠眼球采血，頸椎脫臼處死，至于75%酒精5～10min，無菌條件下，用剪刀在小鼠腹部剪一小口，兩側(cè)撕開腹部皮膚。用一次性無菌注射器向小鼠腹腔內(nèi)注入5ml 1640完全培養(yǎng)基，并用攝子輕輕搖動(dòng)小鼠腹腔。用無菌注射器吸出小鼠腹腔內(nèi)注入的培養(yǎng)基，此過程需注意避免操作污染的發(fā)生。加1640完全培養(yǎng)基至15ml，混勻，用移液器將其加入96孔板中，50μl/孔。放置于37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜培養(yǎng)，以備次日融合用。

2.6 雜交瘤細(xì)胞融合

將骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1：10或1：5的比例混合在一起，1200rpm離心8min，棄上清。用滴管吸凈殘留液體，輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略加松動(dòng)。在室溫下融合：30s內(nèi)加入預(yù)熱的50%PEG4000，邊加邊旋轉(zhuǎn)離心離管，使細(xì)胞與PEG充分接觸；作用90s；加預(yù)熱的不完全培養(yǎng)液，終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml，2ml，4ml，13ml。800rpm離心6min，棄上清，沉淀即為此次融合的細(xì)胞。對(duì)此細(xì)胞再洗一次，盡量除去殘余的PEG，以免影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。加入10ml含20%小牛血清的1640培養(yǎng)液輕輕混懸，勿用力吹打，以免使融合在一起的細(xì)胞散開。將融合細(xì)胞加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔50μl，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日換為HAT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周，而后改為HT選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)兩周。

2.7 雜交瘤細(xì)胞克隆

克隆前先用兩只健康Balb/C小鼠的腹水作飼養(yǎng)細(xì)胞鋪板，用完全培養(yǎng)基將陽性孔中的融合細(xì)胞吹打，移至無菌小瓶中，計(jì)數(shù)后，稀釋至每50μl中含有一個(gè)細(xì)胞。然后，將稀釋的細(xì)胞懸液滴入已鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔50μl。置入5%CO2溫箱37℃培養(yǎng)，次日補(bǔ)加1滴完全培養(yǎng)基，每天觀察一次，發(fā)現(xiàn)污染立即用1N NaOH消除污染，3d左右換液一次，換液時(shí)要特別小心，每孔一個(gè)滅菌好的吸頭，觀察每孔有幾個(gè)克隆株，一般1個(gè)克隆株的孔占多數(shù)，對(duì)有兩個(gè)或沒有細(xì)胞的孔，分別作出標(biāo)記。待克隆細(xì)胞生長(zhǎng)至8～10d時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)出陽性孔。同時(shí)，對(duì)所有的孔均換液，2d后，再檢測(cè)。將兩次檢測(cè)OD值高的孔再次進(jìn)行克隆，直到所有的孔都為陽性，最后選擇OD值高、細(xì)胞活力好、只有一個(gè)克隆的細(xì)胞孔擴(kuò)大培養(yǎng)，液氮保存，同時(shí)收集其上清，放-20℃冰箱凍存。

2.8 腹水的制備

將0.5ml的高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，一周后注入1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔，7～10d后當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時(shí)，抽取腹水，1500r離心10min，取上清，56℃滅活30min，加入50%的甘油，進(jìn)行小包裝分裝，放-20℃冰箱凍存，待用。

2.9 雜交瘤細(xì)胞上清和腹水效價(jià)的測(cè)定

將雜交瘤培養(yǎng)的上清分別作64、128、256、512和1024倍稀釋，陰性對(duì)照為SP2/0培養(yǎng)上清。制備的腹水分別進(jìn)行1∶103、104、105、106、107倍稀釋，陰性對(duì)照用SP2/0制備的腹水作同樣倍數(shù)的稀釋，進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)，P/N值＞2的最高稀釋倍數(shù)即為上清和腹水效價(jià)。

3 結(jié)果

3.1 pVAXE2的鑒定結(jié)果

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)，小提質(zhì)粒，用BamHI和EcoRI酶切，切出1047bp目的片段，篩選得到陽性克隆。然后雙向測(cè)定序列，與PPOCSFV.DNA完全符合，證明構(gòu)建正確。pVAXE2中的E2基因含信號(hào)肽無跨膜區(qū)（1047bp在兔化弱毒株基因組2379～3425位置），酶切鑒定。豬瘟病毒E2重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果，見圖1。

圖1 pVAXE0和pVAXE2的酶切鑒定結(jié)果

3.2 重組菌、E純化E2蛋白的PAGE電泳和薄層掃描測(cè)定純度的檢測(cè)

下頁左圖可見重組E2菌中呈現(xiàn)于預(yù)計(jì)分子量大小相同的表達(dá)產(chǎn)物，二對(duì)照菌則沒有；E2蛋白的純化用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白含量（圖中），按Peirce試劑盒說明書進(jìn)行，中圖可見不同含量的純化的重組E2純化效果及western bloting特異性檢測(cè)結(jié)果，右圖則為薄層掃描測(cè)定的純化E2的純度達(dá)70%。

3.3 免疫小鼠的抗體水平檢測(cè)結(jié)果

以E2抗原為抗原包被酶標(biāo)板，間接ELISA檢測(cè)基因免疫小鼠血清，結(jié)果表明，6只免疫小鼠均產(chǎn)生明顯的抗體應(yīng)答，第二次免疫后血清中抗體水平明顯高于第一次免疫，見表1。

表1 基因免疫Balb/c小鼠血清抗體檢測(cè)結(jié)果

3.4 雜交瘤細(xì)胞上清和腹水抗體滴度的檢測(cè)結(jié)果

將獲得的17株（10株E2，7株E0）雜交瘤細(xì)胞株的細(xì)胞培養(yǎng)上清和制備的腹水經(jīng)間接ELISA檢測(cè)，上清效價(jià)在1∶256～512， 腹水效價(jià)在 1： 105～106， 見表 2～3。

4 討論

E2是瘟病毒的囊膜糖蛋白，在CSFV中E2位于ORF的精氨酸690-谷氨酸1062位，由373個(gè)氨基酸殘基組成，有5個(gè)N端的糖基化位點(diǎn)，這些糖基化位點(diǎn)對(duì)CSFV的感染非常重要[1,2]；BVDV的E2位于ORF的2077～3198位核苷酸，由374個(gè)氨基酸殘基組成，含有19個(gè)半胱氨酸殘基和5個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在BVDV的不同毒株都是非常保守的[3]。瘟病毒的E2蛋白多以二聚體的形式存在，在細(xì)胞信號(hào)肽的作用下從多聚蛋白上游離下來，C端含有疏水的膜錨定區(qū)域，錨定在囊膜上。CSFV E2蛋白存在4個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)構(gòu)域A、B、C、D，Wensvoort用13株抗CSFV McAb借助競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法和抗原捕捉測(cè)定法研究了CSFV的抗原表位[4]和Van Rinjin通過表達(dá)確實(shí)突變體證實(shí)4個(gè)抗原結(jié)構(gòu)域位于E2 N端的690～860位氨基酸殘基，其中A區(qū)是高度集中的抗原表位集中區(qū)；B和C是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要部位，均為非保守區(qū)；而D區(qū)既不保守也不誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生。E2是瘟病毒主要保護(hù)性抗原，長(zhǎng)期以來被稱為瘟病毒研究的主要對(duì)象，是人們研究新型疫苗的主要靶基因，也是建立CSF血清學(xué)檢測(cè)方法首選抗原。豬瘟E2蛋白一直是豬瘟研究的熱點(diǎn)。單克隆抗體以其高度的特異性和高度的敏感性而在CSFV的生物學(xué)研究中起重要作用。本研究通過過構(gòu)建的E2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒制備成基因疫苗，通過免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，大量篩選豬瘟病毒雜交瘤細(xì)胞株篩選出17株分泌抗E2抗體的雜交瘤細(xì)胞株，克隆3次后檢測(cè)的培養(yǎng)上清和腹水效價(jià)分別為1∶256～512和1：105～106。接種豬瘟病毒的PK-15，用17株雜交瘤細(xì)胞株的制備的腹水為一抗，以熒光標(biāo)記的鼠二抗的間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，17株單抗中，有7株呈現(xiàn)強(qiáng)烈的熒光染色，為CSFV的檢測(cè)和豬瘟病毒的研究提供試劑奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖2 重組E2的SDS-PAGE電泳、western bloting和純化結(jié)果

表2 間接ELISA檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清滴度

表3 間接ELISA檢測(cè)腹水滴度