陳 靜， 夏艷秋， 顧冬瑩， 朱 強(qiáng)

(江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室/淮海工學(xué)院海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005)

芽孢桿菌被認(rèn)為兼有改善水生動物消化道和改良水環(huán)境的雙重功效，作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖上有著重要用途。目前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用得較多的芽孢菌主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。芽孢菌在生長過程中產(chǎn)生大量的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等水解酶系，幫助機(jī)體消化、吸收飼料，降低飼料系數(shù)；產(chǎn)生B族維生素及維生素C，有助于提高機(jī)體的免疫活性；同時代謝產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸，可降低消化道內(nèi)pH值和氨的濃度，維持機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，起到防病、抗菌的雙重作用。

凡隆氣單胞菌在醫(yī)學(xué)上稱維羅納氣單胞菌、維隆氣單胞菌，獸醫(yī)上常譯作凡隆氣單胞菌[1]，是近些年確定的氣單胞菌科的新種，能引起人的局部和系統(tǒng)感染[2]，同時在水產(chǎn)養(yǎng)殖上也逐漸成為危害性較大的病原菌。如該菌曾引發(fā)孟加拉國魚類的流行性潰瘍綜合征[3]。在國內(nèi)，該菌感染能使丁、羅非魚、中華絨螯蟹、泥鰍、甌江彩鯉等水產(chǎn)動物患病[4-8]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，氣單胞菌病的水產(chǎn)防治主要是靠水體消毒和內(nèi)服有效抗生素?？股貫E用帶來的耐藥菌產(chǎn)生存在公共安全衛(wèi)生隱患。所以，尋找綠色安全漁藥成為當(dāng)前的重點。本研究通過拮抗試驗來篩選對凡隆氣單胞菌有抑制作用的菌株并對其抑制特性進(jìn)行研究，為開發(fā)水產(chǎn)微生物活性制劑提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌種

出發(fā)菌株：由筆者所在課題組分離自連云港海域海泥樣品中，共36株。

指示靶病原菌：凡隆氣單胞菌溫和生物型(Aeromonasveroniibiovar.sobria)NQ菌株(由淮海工學(xué)院秦蕾博士分離自發(fā)病泥鰍，人工感染試驗證實為泥鰍發(fā)病的致病源)。

1.2 培養(yǎng)基

TSB培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

TSA培養(yǎng)基：胰蛋白胨17.0 g，大豆蛋白胨3.0 g，NaCl 5.0 g，葡萄糖2.5 g，瓊脂粉15.0～20.0 g，K2HPO42.5 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 出發(fā)菌株對凡隆氣單胞菌NQ拮抗試驗 初篩：將凡隆氣單胞菌NQ接種至TSB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)24 h，取100 μL涂布在TSB固體平板上，然后將出發(fā)菌株點種到涂布好的TSB固體平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h，觀察拮抗效果及測量抑菌圈直徑。復(fù)篩：將出發(fā)菌株接種于TSB培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵，將發(fā)酵液離心，取上清液用 0.22 μm 無菌濾膜過濾，在置于涂布凡隆氣單胞菌的TSA平板上的牛津杯中加入50 μL上述濾液。于28 ℃培養(yǎng)一定時間后，測量發(fā)酵液的抑菌圈直徑。

1.3.2 菌株的分類鑒定

1.3.2.1 形態(tài)特征 參照文獻(xiàn)[9]，將菌株接種到TSA平板，于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞形態(tài)采用革蘭氏染色和簡單染色進(jìn)行觀察，并進(jìn)行芽孢染色和鞭毛染色觀察。

1.3.2.2 菌體的生理生化反應(yīng)研究 采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管鑒定。按照操作說明在細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中接入 50 μL 對數(shù)期菌株培養(yǎng)懸液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，18～24 h后觀察并記錄結(jié)果。

1.3.2.3 細(xì)菌的16S rDNA PCR擴(kuò)增與測序

1.3.2.3.1 細(xì)菌DNA提取 (1)取菌株過夜培養(yǎng)液1.5 mL于EP管中，12 000 r/min離心2 min，棄去上清液。(2)加 567 μL TE緩沖液，用定量移液器吹打懸浮沉淀，并加30 μL 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)，15 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混勻，37 ℃保溫1 h。(3)加100 μL 5 mol/L NaCl，充分混勻；再加80 μL CTAB/NaCl溶液，混勻；65 ℃保溫10 min。(4)用等體積酚 ∶氯仿 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1)抽提，離心4～5 min，將上清液移至干凈EP管。(5)加0.6～0.8倍體積的異丙醇，顛倒混合，冰箱冷凍層靜置15 min，沉淀DNA。(6)12 000 r/min 離心10 min使DNA沉淀，加40-TE溶解，-20 ℃ 保存。作為PCR模板。

1.3.2.3.2 PCR擴(kuò)增 引物設(shè)計[10]：16S rDNA正向引物為(ALF165312)：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCT-3′，16S rRNA的通用引物(反向引物：ALF165313)：5′-CGGCTACCT-TGTTACGAC -3′，以上引物均由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。

基因PCR擴(kuò)增：50 μL PCR反應(yīng)體系：基因組DNA模板2 μL，10×PCR buffer 5 μL，10 mmol/L MgCl24 μL，2.5 μmol/L dNTP 0.5 μL，2.5 μmol/L上游引物和下游引物各1 μL，5 U/μLTaqTMDNA聚合酶(TaKaRa)0.5 μL，最后加無菌雙蒸水至50 μL，混合。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢查并拍照。PCR產(chǎn)物純化后，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司測序。

1.3.2.5 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析 將所測定的16S rDNA序列通過NCBI-NLM中Nucleotide-nucleotide Blast程序與GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中核苷酸序列進(jìn)行同源性分析[11]，并通過數(shù)據(jù)庫下載與試驗菌株親緣關(guān)系較近并已經(jīng)確證的序列，用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對，采用MEGA 4軟件的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.3 菌株生長曲線以及不同時間段發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性的研究 將菌株培養(yǎng)過夜搖瓶作為種子液以3%接種量接種大搖瓶28 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)，分別取不同時間培養(yǎng)液測定D600 nm值和用雙層平板牛津杯法測定發(fā)酵離心清液的抑菌圈大小，繪出生長曲線和不同發(fā)酵時間抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 凡隆氣單胞菌拮抗分離、篩選

通過對36株出發(fā)菌株初篩和復(fù)篩試驗，得到1株對凡隆氣單胞菌(Aeromonasveronii)NQ拮抗活性明顯的菌株 chenj-1。由表1、圖1可知，菌株chenj-1對凡隆氣單胞菌具有較強(qiáng)的拮抗作用，并且可知其主要拮抗物質(zhì)為胞外產(chǎn)物。

表1 chenj-1菌株對凡隆氣單胞菌的拮抗效果

2.2 菌株的分類鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 菌株chenj-1在TSB培養(yǎng)基上呈淡黃色菌落，表面粗糙，邊緣不整齊。由圖2可知，菌株chenj-1革蘭氏染色呈陽性，短桿狀、兩端鈍圓，多單個或成對出現(xiàn)，有芽孢，芽孢囊稍有膨大、呈橢圓形，中生到次端生，有稀疏的周生鞭毛。根據(jù)形態(tài)特征初步判斷菌株屬于芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。

2.3 菌株的生理生化鑒定

根據(jù)表2、圖2，結(jié)合生理生化鑒定和細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析，并參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[12]及常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[9]對菌株chenj-1初步歸類為革蘭氏陽性芽孢桿菌屬。

表2 菌株chenj-1生理生化反應(yīng)

2.4 菌株chenj-1 16S rDNA序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，由凝膠成像系統(tǒng)下顯示的圖像可知，引物擴(kuò)增出的序列長度約為1.5 kb(圖3)，符合常規(guī)的16S rDNA序列長度。

經(jīng)測序，菌株chenj-1 16S rDNA核苷酸序列大小為 1 398 bp，其序列已在GenBank中登記，登記號為JN051503。經(jīng)與GenBank數(shù)據(jù)庫中報道的16S rDNA核苷酸序列比對，選取芽孢桿菌屬各種的16S rDNA核苷酸序列與菌株的16S rDNA核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖4可知，菌株與B.amyloliquefacien(X60605、AY608741、AY603658、DQ993675)位于同一簇群，親緣關(guān)系最近。根據(jù)菌株的形態(tài)特征、生理生化試驗、16S rDNA核苷酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析，將菌株初步鑒定為海洋解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)。

2.5 菌株chenj -1生長曲線及不同發(fā)酵時間抑菌活性

將菌株chenj -1培養(yǎng)過夜搖瓶作為種子液以3%接種量接種大搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)(28 ℃，160 r/min)，分別取不同時間發(fā)酵液測定D600 nm值和用雙層平板牛津杯法測定發(fā)酵離心上清液的抑菌圈大小，繪出生長曲線和不同發(fā)酵時間抑菌圈大小。

由圖5可知，菌株chenj-1生物量在20 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，28 h發(fā)酵上清液的抑菌活性最高，抑菌圈直徑為 15.8 mm，說明抑菌活性物質(zhì)在穩(wěn)定期大量產(chǎn)生并在穩(wěn)定中后期積累，對于擴(kuò)大生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌屬被認(rèn)為是一類產(chǎn)生多種抗微生物活性物質(zhì)的微生物[13-14]，而解淀粉芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一員，也有不少文獻(xiàn)展示其在抑制病原微生物方面的活性，楊勝遠(yuǎn)等獲得1株解淀粉芽孢桿菌K6菌株有廣譜抗菌活性，包括對細(xì)菌、酵母、霉菌和白色念珠菌都具有抑制作用[15]，Lim等從解淀粉芽孢桿菌RX7菌株分離了1種廣譜拮抗多種病原細(xì)菌和白色念珠菌的細(xì)菌素[16]；而Seung等、Alvindia等和Calvo等分別獲得具有控制植物真菌性病原微生物的解淀粉芽孢桿菌菌株CNU114001、DGA14、BUZ-1[17-19]。

本試驗采集江蘇省連云港及附近海域海泥、海水及海洋生物樣品，分離得到36株海洋芽孢桿菌并從中篩選到1株強(qiáng)拮抗凡隆氣單胞菌的菌株chenj -1。通過形態(tài)學(xué)、生理生化(包括耐鹽性)試驗及16S rDNA基因比對初步歸類為海洋解淀粉芽孢桿菌。在對菌株chenj -1生長曲線及其不同時間段發(fā)酵代謝產(chǎn)物的抑菌活性初步研究發(fā)現(xiàn)，菌株生物量與代謝活性產(chǎn)物量呈正相關(guān)，生物量在20 h達(dá)到最大值并進(jìn)入平衡期， 28 h發(fā)酵液抑菌圈直徑最大(15.8 mm)。試驗結(jié)果為生物防治由凡隆氣單胞菌引起的水產(chǎn)動物疾病提供了理論依據(jù)。經(jīng)初步試驗，B.amyloliquefacienchenj-1其硫酸銨鹽析產(chǎn)物抑菌活性有所提高，但具體活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和組分需要進(jìn)一步研究。