晏敏，周宇，賀肖寒，梅明鑫，董全

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

檸檬為蕓香科常綠小喬木[1]。營養(yǎng)價值高，含有大量的檸檬酸、VC、檸檬苦素和柚皮苷等[2]，具有提高免疫力、預(yù)防壞血病[3]、降低血壓[4]、降血脂[5]和美容等多種功效，其皮和果肉的利用價值高。紅檸檬是原產(chǎn)自地中海流域的檸檬品種。紅檸檬果實顏色艷麗，皮薄多汁，出汁率達(dá)65%以上[6]。紅檸檬不僅美味，而且具有抗氧化能力，有益于身體健康，將其制作成澄清果汁可以滿足消費者的需求，同時也拓寬了紅檸檬的銷售市場。而果膠豐富的果汁需要進(jìn)行澄清處理，澄清工藝對于保證果汁穩(wěn)定性、延長貯藏期和提高果汁感官品質(zhì)等方面具有重要作用。新鮮果汁中的混濁主要是由聚合物如果膠物質(zhì)，半纖維素，纖維素，木質(zhì)素和淀粉，以及一些化合物如多酚，蛋白質(zhì)，單寧和金屬引起的[7-9]。這些物質(zhì)需要降解成小分子或者將其去除，以制造清亮和穩(wěn)定性好的果汁。本研究采用果膠酶、復(fù)合酶(果膠酶與纖維素酶復(fù)配)、殼聚糖、膨潤土和硅藻土5種澄清劑對紅檸檬汁進(jìn)行澄清處理，研究這5種澄清劑的處理效果，以期得到紅檸檬汁的最優(yōu)澄清工藝條件，為澄清紅檸檬汁的加工提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅檸檬由重慶上田生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，榨汁后冷凍。

纖維素酶(酶活力為3 U/mg)、半乳糖醛酸,北京索萊寶科技有限公司；殼聚糖(生化試劑),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膨潤土(分析純)、次甲基藍(lán),天津市大茂化學(xué)試劑廠；硅藻土(化學(xué)純)、果膠酶(生化試劑，酶活力為500 000 U/g)、偏磷酸、NaHCO3、2,6-二氯靛酚、NaOH、葡萄糖、CuSO4、酒石酸鉀鈉、無水乙醇、KH2PO4、Na2CO3、鄰苯二甲酸氫鉀、抗壞血酸、乙酸(分析純),成都市科龍化工試劑廠；HCl、H2SO4(分析純),重慶川東化工有限公司；咔唑(純度98%),阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；甲醛(分析純),重慶吉元化學(xué)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

722G可見光分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、THZ-82恒溫振蕩器,常州智博睿儀器制造有限公司； FA2004A精密型電子天平,上海精天電子儀器有限公司；E-201-CpH復(fù)合電極,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；手持折光儀,杭州聯(lián)測自動化技術(shù)有限公司；Centrifuge 5810R型臺式低溫離心機(jī),德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 紅檸檬澄清工藝流程

原料→選果→洗滌→瀝干→榨汁→冷凍(-20℃)→解凍(4℃)→粗濾→加澄清劑→沉淀→離心(6 000 r/min離心10 min)→分析上清液[10]。

1.3.2 單因素試驗

查相關(guān)閱文獻(xiàn),設(shè)定紅檸檬澄清工藝條件為：(1)果膠酶澄清[11-13]：果膠酶添加量0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/100 mL；pH 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、5.0、5.5；澄清時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；澄清溫度40、45、50、55、60、65 ℃。加入果膠酶反應(yīng)結(jié)束后需要在80 ℃條件下滅酶2 min，然后再離心測定其透光率。(2)復(fù)合酶澄清[14-16]：果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比1∶1、2∶1 、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1；復(fù)合酶用量0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g/100mL；pH 3.0、 3.5、 4.0、 4.5、5.0、5.5；澄清時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；澄清溫度35、40、45、50、55、60 ℃。加入復(fù)合酶反應(yīng)結(jié)束后需要在80 ℃條件下滅酶2 min，然后再離心測定其透光率。(3)殼聚糖法澄清[17]：用量0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 g/L；澄清時間20、40、60、80、100、120 min；澄清溫度20、30、40、50、60、70 ℃ ；pH 2.5、3.0、 3.5、 4.0、 4.5、5.0。(4)膨潤土澄清[18-19]:用量1、2、3、4、5、6 g/L；澄清時間5、10、15、20、25、30 min；澄清溫度35、40、45、50、55、60 ℃。(5)硅藻土澄清[20]：用量1、2、3、4、5、6 g/L；澄清時間5、10、15、20、25、30 min；澄清溫度35、40、45、50、55、60 ℃ 。

1.3.3 指標(biāo)的測定

澄清度：采用分光光度計進(jìn)行紅檸檬汁的測定，以零杯作為參比，比色杯為1 cm，在適宜的波長下測紅檸檬汁的透光率，用透光率T%表示紅檸檬汁的澄清度。

波長的確定：取一定量的紅檸檬原汁，過濾后在6 000 r/min的條件下離心10 min。取其上清液用分光光度計測定波長在500～800 nm的透光率。

果膠含量的測定——NY/T2016—2011 ；

可溶性固形物含量的測定——NY/T2637—2014；

可滴定酸含量的測定——GB/T12456—2008；

總糖含量的測定——GB/T15038—2006；

VC含量——GB5009.86—2016。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗選出較好的澄清劑果膠酶并確定工藝條件最優(yōu)范圍，再利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Benhnken試驗設(shè)計原理[21]，對澄清工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到最佳澄清技術(shù)條件。因素水平編碼見表1。

表1 果膠酶澄清紅檸檬汁響應(yīng)面試驗因素水平表Table 1 Pectinase clarification red lemon juice response surface test factor level table

2 結(jié)果與分析

2.1 紅檸檬果汁透光率最適波長的確定

從圖1可以看出，在波長717 nm處，紅檸檬果汁的透光率最大，之后趨近于平穩(wěn)，故確定717 nm為測定透光率的最適波長。

圖1 測定波長對果汁透光率的影響Fig.1 Effect of determination wavelength on juice transmittance

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 酶法澄清對紅檸檬汁澄清度的影響

由圖2可知，在果膠酶用量0.10 g/100mL、澄清時間1.5 h和溫度50 ℃；果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1∶1、用量0.10 g/100mL、時間1 h和溫度50 ℃的條件下，pH在4～4.5范圍內(nèi)果膠酶和復(fù)合酶的澄清效果都較好，在pH為4.5時果膠酶和復(fù)合酶的活性都最大，澄清效果最好。pH在4.5～5時，果膠酶澄清效果迅速下降，而復(fù)合酶澄清效果緩慢下降并澄清效果較好，說明復(fù)合酶使用的pH范圍比果膠酶寬。pH較低時會降低酶活性，pH過高則會導(dǎo)致果膠酶失活，使果膠酶失去澄清能力。因此，pH 4.5為果膠酶和復(fù)合酶的最佳澄清條件。

圖2 pH對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.2 Effect of pH on clarity of red lemon juice

由圖3可以看出，在果膠酶pH 4.0、澄清時間1.5 h和溫度50 ℃；果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1∶1、pH 4.0、時間1 h和溫度50 ℃的條件下，果膠酶用量在0.05～0.1 g/100mL時透光率急劇上升，用量在0.1～0.2 g/100mL透光率緩慢上升，隨后透光率趨于穩(wěn)定并有所下降。這是因為果膠酶添加量少時，不能將果汁中的果膠酶有效地分解；果膠酶過量，則會有部分將溶解在果汁里造成透光率下降。復(fù)合酶用量低于0.2 g/100mL時，澄清度隨著用量的增加而急劇上升，高于0.2 g/100mL時，澄清度有所下降，這可能是由多余的復(fù)合酶溶解于果汁中造成的，并且還會增加澄清的成本。因此，果膠酶和復(fù)合酶用量都選擇0.2 g/100mL左右較好。

圖3 用量對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.3 Effect of dosage on clarity of red lemon juice

由圖4可知，在果膠酶用量0.10 g/100mL、pH 4.0和溫度50 ℃；果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1∶1、用量0.10 g/100mL、pH 4.0和溫度50 ℃的條件下，時間在0.5～1 h，果膠酶和復(fù)合酶的澄清效果隨著時間的延長迅速變好，這是因為時間太短酶與底物反應(yīng)不完全。時間超過1h后，澄清度先下降隨后趨于平穩(wěn)，這可能是因為果汁營養(yǎng)豐富，時間過長會有微生物污染引起渾濁。因此，果膠酶和復(fù)合酶的澄清時間應(yīng)選擇1 h左右。由圖5可知，在果膠酶用量0.10 g/100mL、pH 4.0和時間1.5 h；果膠酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1∶1、用量0.10 g/100mL、pH 4.0和時間1.0 h的條件下，果膠酶的最適溫度為50 ℃，溫度低會抑制酶的活性，溫度過高則會破壞果膠酶結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致澄清效果不好。復(fù)合酶溫度在40～45 ℃澄清效果較好，考慮到能源的節(jié)約，選擇40 ℃作為最佳條件。由圖6可知，復(fù)合酶用量0.10 g/100mL、時間1.0 h、pH 4.0和溫度50 ℃的條件下，果膠酶與纖維素酶的最佳質(zhì)量比為3∶1左右，果膠酶所占比例過大或過小都會影響澄清效果。

圖4 時間對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.4 The effect of time on the clarity of red lemon juice

圖5 溫度對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.5 Effect of temperature on clarity of red lemon juice

圖6 復(fù)合酶比例對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.6 Effect of compound enzyme ratio on clarity of red lemon juice

2.2.2 殼聚糖澄清對紅檸檬汁澄清度的影響

在澄清時間為60 min、溫度40℃和pH 3.5的條件下，由圖7可以看出，殼聚糖用量低于1.25 g/L時，果汁澄清度隨著用量的增加而上升，這是因為果汁中的大分子物質(zhì)與殼聚糖結(jié)合成絮凝沉淀物更充分。而殼聚糖用量高于1.25 g/L時，果汁澄清度有所下降，這是因為殼聚糖過量引起的果汁渾濁。因此，殼聚糖用量選擇1.25 g/L，這時的澄清效果最好。由圖8可知，在殼聚糖用量1.0 g/L、溫度40℃和pH 3.5的情況下，澄清度隨著時間延長而緩慢上升，這是由于殼聚糖與紅檸檬果汁中果膠等帶負(fù)電荷物質(zhì)相互作用，產(chǎn)生絮凝沉淀物的沉降速度有限，沉降需要一定的時間[22]。但時間超過100 min后澄清度逐漸下降，絮凝沉淀物在果汁中停留時間過長，會造成沉淀物的部分重新溶解，導(dǎo)致沉淀物減少，果汁透光率降低[23]。因此，時間選擇100 min時澄清效果最佳。

圖7 殼聚糖用量對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.7 Effect of chitosan dosage on clarity of red lemon juice

圖8 澄清時間對澄清度的影響Fig.8 Clarifies the effect of time on clarity

由圖9可知，在殼聚糖用量1.0 g/L、澄清時間為60 min和溫度40℃的條件下，殼聚糖澄清紅檸檬的最佳pH值為3.0，因為殼聚糖分子只能在酸性溶液中緩慢溶解,pH過高時會導(dǎo)致殼聚糖的溶解度降低,同樣也會影響其降解效果。由圖10可知，在殼聚糖用量1.0 g/L、澄清時間為60 min和pH 3.5的條件下，溫度低于60 ℃時，隨著溫度的升高透光率逐漸增大，這是因為溫度的升高會加快分子的擴(kuò)散速度，有利于殼聚糖與之結(jié)合。當(dāng)溫度高于60 ℃時，透光率隨著溫度的升高而減小，可能是因為溫度過高造成絮凝沉淀物的部分重新溶解,最終引起檸檬汁透光率下降[24]。因此，澄清溫度在60 ℃時澄清效果最好。

圖9 pH對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.9 Effect of pH on clarity of red lemon juice

圖10 澄清溫度對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.10 shows the effect of clarification on the clarity of red lemon juice

2.2.3 膨潤土和硅藻土對紅檸檬汁澄清度的影響

在澄清時間都為15 min和溫度45 ℃的條件下研究膨潤土和硅藻土用量對紅檸檬汁的澄清效果；膨潤土和硅藻土的用量都為3 g/L和溫度45 ℃的條件下研究時間對紅檸檬汁的澄清效果；膨潤土和硅藻土的用量都為3 g/L和時間為15 min的條件下溫度對紅檸檬汁的澄清效果，結(jié)果見圖11～圖13，由圖11～圖13可以看出雖然膨潤土和硅藻土的用量，時間和溫度對紅檸檬汁的澄清效果有所影響，但是總的來說膨潤土和硅藻土的澄清效果都不好。透光率與原果汁透光率相近，對紅檸檬汁幾乎沒有澄清效果。

圖11 時間對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.11 The effect of time on the clarity of red lemon juice

圖12 溫度對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.12 Effect of temperature on clarity of red lemon juice

圖13 膨潤土和硅藻土用量對紅檸檬汁澄清度的影響Fig.13 Effect of dosage on clarity of red lemon juice

根據(jù)以上單因素試驗結(jié)果可以了解到果膠酶、復(fù)合酶和殼聚糖的澄清效果好，其中果膠酶和殼聚糖使用方便并且相對更經(jīng)濟(jì)。雖然復(fù)合酶作用的適宜pH為4.0～5.0，溫度為40℃～65℃；果膠酶的適宜pH為4.0～4.5，溫度為35℃～55℃，復(fù)合酶作用的適宜pH范圍更廣也更耐高溫。但果膠酶適宜pH范圍能夠滿足紅檸檬汁澄清工藝的要求；并且在果汁加工中高溫對果汁品質(zhì)會有影響，選擇低溫條件對果汁加工更有利。果膠酶使用方便，復(fù)合酶使用前需要按比例復(fù)配，且價格較高。因此，在復(fù)合酶和果膠酶效果類似的情況下選擇果膠酶對紅檸檬果汁進(jìn)行澄清處理。為了選擇一種澄清效果好并能很好地保持紅檸檬原有營養(yǎng)品質(zhì)的澄清工藝，接下來將會進(jìn)一步研究果膠酶和殼聚糖澄清對紅檸檬汁品質(zhì)的影響。

2.3 澄清工藝對紅檸檬品質(zhì)的影響

由表2可以看出，果膠酶和殼聚糖對紅檸檬汁的澄清效果相當(dāng)，果膠酶澄清對Vc和總糖的保留率更高，殼聚糖對可溶性固形物、總酸和果膠的保留率更高?？偹岷凸z含量高不利于后期的加工和貯藏，酸度過高也會影響紅檸檬汁的口感，因此，選擇果膠酶對紅檸檬汁進(jìn)行澄清處理。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面多元回歸模型的建立與分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面試驗，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表3。運用Design-Expert 8.0軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到紅檸檬汁澄清工藝參數(shù)的二次回歸方程為：

Y=-1 861.56-428.10A+124.34B+17.71C+697.99D+75.00AB+2.00AC+136.00AD-2.04BC+3.70BD-1.51CD-776.00A2-25.61B2-0.09C2-76.71D2。

表2 各項指標(biāo)測定結(jié)果Table 2 Indicators of the determination of the results

表3 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Response surface Box-Behnken design arrangement and experimental results

對二次回歸方程進(jìn)行方差分析和回歸模型系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示模型的顯著性水平p<0.000 1，表明該二次方程模型極為顯著；同時，失擬項p>0.05，表明差異不顯著，說明殘差均由隨機(jī)誤差引起，建立的回歸模型能夠較好地擬合果膠酶添加量、pH、時間及溫度對紅檸檬汁透光率的影響情況。該方程的多元相關(guān)系數(shù)R2為0.998 8，說明該模型與實際擬合較好。

表4 實驗結(jié)果回歸模型方差分析Table 4 Experimental results regression model variance analysis

注：*，p<0.05，差異顯著；**，p<0.01，差異極顯著。

2.4.2 果膠酶澄清紅檸檬汁的響應(yīng)面分析

等高線的形狀能反映因素之間交互作用的強(qiáng)弱大小，形狀越圓說明兩因素之間的交互作用越不顯著，而形狀為橢圓形則表示該交互作用顯著[25]。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(表4)可知用量和溫度之間的交互效應(yīng)不顯著，其他因素之間都有顯著的交互作用。交互作用的響應(yīng)面圖見圖14。

圖14 兩因素交互作用對透光率的影響響應(yīng)面圖Fig.14 Effect of two factors on the transmittance response

2.4.3 果膠酶澄清紅檸檬汁響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ偷尿炞C

利用模型得到果膠酶澄清紅檸檬汁的最佳工藝條件為加酶量0.22 g/100mL、時間1.04 h、溫度50.32 ℃、pH 4.27，預(yù)測透光率為94.30%。為了驗證回歸模型的有效性，根據(jù)實際操作的方便性，將最佳工藝條件調(diào)整為加酶量0.22 g/100 mL、時間62 min、溫度50.3 ℃、pH 4.3，在此條件下進(jìn)行驗證試驗得到的透光率為93.8%，結(jié)果表明實際測量值接近預(yù)測值，說明此回歸模型有效。本實驗的研究結(jié)果與李素清等[10]用果膠酶對青檸汁進(jìn)行澄清處理的研究結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論

使用果膠酶、復(fù)合酶、殼聚糖、膨潤土和硅藻土這5種澄清劑對紅檸檬進(jìn)行澄清處理。通過單因素實驗可以了解到膨潤土和硅藻土對紅檸檬汁幾乎沒有澄清作用，透光率只有2.5%左右，果膠酶、復(fù)合酶和殼聚糖澄清效果較好，透光率能達(dá)到89%左右。其中果膠酶相對較便宜、使用方便并能較好地保持紅檸檬品質(zhì)，因此，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)一步對果膠酶澄清紅檸檬汁的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為加酶量0.22 g/100mL、時間62 min、溫度50.3 ℃、pH 4.3，在此條件下進(jìn)行驗證試驗得到透光率為93.8%，與理論值的相對誤差僅為0. 53% 。結(jié)果表明實際測量值接近預(yù)測值，此二次回歸模型擬合度良好，可以用于指導(dǎo)紅檸檬澄清汁的生產(chǎn)。關(guān)于澄清操作對紅檸檬風(fēng)味物質(zhì)的影響，有待于進(jìn)一步研究。