馬仕坤，關(guān) 劍，王 丹，甄宏楠，謝喜秀

變態(tài)反應(yīng)性疾病如變應(yīng)性鼻炎、變應(yīng)性哮喘、食物過敏、藥物過敏、特應(yīng)性皮炎等是困擾人們生活和工作的常見健康問題，變應(yīng)性休克更危及生命。2013年世界變態(tài)反應(yīng)組織(World Allergy Organization，WAO)發(fā)布的白皮書顯示，目前全球有2.0～2.5億食物過敏患者、約3億哮喘患者和4億變應(yīng)性鼻炎患者，藥物過敏的患病率高達10%[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)統(tǒng)計，每年全球約25萬人死于哮喘，并且哮喘的發(fā)病率仍呈上升趨勢，預(yù)計到2025年患病人數(shù)將達到4億[2]。我國哮喘患病總?cè)藬?shù)預(yù)計3千萬，其中兒童約1千萬[3]。綜合2010、2012及2013年全國衛(wèi)生健康調(diào)查數(shù)據(jù)，有1.99%的受訪應(yīng)答者患有哮喘[4]。國際兒童哮喘及變態(tài)反應(yīng)性疾病研究(International study of asthma and allergies in childhood，ISAAC)的數(shù)據(jù)顯示，我國兒童哮喘、變應(yīng)性鼻炎、特應(yīng)性皮炎的患病率持續(xù)上升[5]。關(guān)于食物過敏患病率時間趨勢的一項單中心研究顯示，從1999年到2009年，0到24月齡兒童食物致敏率從9.9%上升到18%，食物過敏率從3.5%上升到7.7%，其中雞蛋和牛奶過敏最為常見[6-7]。目前變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療藥物主要包括抗組織胺藥、白三烯受體拮抗劑、糖皮質(zhì)激素以及用于哮喘的支氣管擴張劑等，但均為暫時性緩解癥狀。變應(yīng)原特異的免疫治療(allergen-specific immunotherapy，AIT)是唯一針對病因的長期有效的治療手段。1911年Noon[8]首次發(fā)表利用花粉變應(yīng)原提取液皮下注射進行免疫治療的研究，迄今AIT已有100余年的歷史，但AIT難以普及，其原因主要是接受AIT的患者需要在長達3～5年的時間內(nèi)接受上百次的注射才能達到理想效果，且治療過程中存在誘發(fā)嚴重全身不良反應(yīng)的風(fēng)險[9-10]。新的舌下含服的免疫療法給藥方便，但局部不良反應(yīng)較多，相比皮下注射給藥途徑其療程并未縮短[11-12]，并且也有發(fā)生嚴重不良反應(yīng)的風(fēng)險[13]。

基因治療是一種新型高效的臨床治療策略，在腫瘤、遺傳性疾病的治療中已顯示了明確的療效及優(yōu)勢，在變態(tài)反應(yīng)性疾病領(lǐng)域也有了一些嘗試[14-15]。胃腸道黏膜相關(guān)淋巴組織是機體最大也是最復(fù)雜的免疫器官，進入腸道的抗原通過腸上皮細胞、M細胞、樹突狀細胞等攝取并處理，提呈給腸上皮淋巴細胞或腸道集合淋巴結(jié)中的淋巴細胞，進而發(fā)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)。通常情況下，胃腸道黏膜相關(guān)淋巴組織對食物蛋白和共生菌等無害抗原表現(xiàn)為耐受，而對致病細菌、病毒等則發(fā)生免疫應(yīng)答。胃腸道預(yù)先接觸非致病性抗原后，再用同樣的抗原通過腸外途徑免疫動物不會引起明顯的全身反應(yīng)，此即誘導(dǎo)口服耐受[16]，還可以減輕遠處其他組織的炎癥性免疫反應(yīng)，如皮膚的遲發(fā)超敏反應(yīng)、速發(fā)變態(tài)反應(yīng)和胰島炎等[16-17]，也稱為旁觀者效應(yīng)。白細胞介素(interleukin，IL)-10是口服耐受最重要的效應(yīng)分子之一，具有強大的抗炎效應(yīng)和誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞生成的能力，在口服耐受誘導(dǎo)早期發(fā)揮關(guān)鍵作用，IL-10缺乏將導(dǎo)致建立耐受失敗，而在口服抗原中加入微量的IL-10即可增強免疫耐受效果[18]。本研究擬構(gòu)建一種可用于口服的、以不致病復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的重組變應(yīng)原基因疫苗，融合表達免疫調(diào)節(jié)因子IL-10及模式變應(yīng)原卵清蛋白(ovalbumin,OVA)，為后續(xù)驗證該疫苗對變態(tài)反應(yīng)性疾病的預(yù)防及治療效應(yīng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

目的基因小鼠IL-10和模式OVA的DNA序列(南京金斯瑞生物科技公司合成)；腺病毒穿梭質(zhì)粒pHBAd-MCMV、腺病毒骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG及人胚腎細胞系HEK293 細胞(上海漢恒生物公司)；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA ladder(購自Fermentas公司)；質(zhì)粒DNA大/小抽提試劑盒(康為世紀公司)；DMEM、胎牛血清、胰酶(美國Hyclone公司)；雙抗(美國Invitrogen公司)；LipofiterTM 轉(zhuǎn)染試劑[漢恒生物科技(上海)有限公司]；小鼠 Instant IL-10 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建：重疊PCR技術(shù)連接小鼠IL-10與OVA的DNA序列，設(shè)計引物序列如下：F：TCCAGACCCGGGACCGAATTCGCCACCATGCCT GGCTCAGCAC；R1：GCCCCCTCCGCCGCCTCCGC TTTTCATTTTGATCATCA；F2：GGAGGCGGCGGAG GGGGCGCCACCATGGGCTCCATCGGCGCAGCA；R：CGCTCGAGATCTGTAGAATTCAGGGGAAACACATCT GCCAAA。PCR產(chǎn)物克隆到穿梭質(zhì)粒載體pHBAd-MCMV后轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，挑取陽性菌落，采用菌液PCR法篩選鑒定目的基因插入情況(圖2)，將陽性克隆送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序進行鑒定，確定插入正確序列的重組穿梭質(zhì)粒pAdIL-10-OVA。

1.2.2 重組腺病毒包裝、擴增及滴度測定：取重組穿梭質(zhì)粒pAdIL-10+OVA 2 μg及骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG 4 μg，脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染融合度70%～80%的293細胞。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮的細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞變化，待大部分細胞變大變圓且呈葡萄狀并從培養(yǎng)瓶底部脫落時收獲病毒。將培養(yǎng)瓶中所有細胞及培養(yǎng)液收于15 ml離心管中，用液氮及37 ℃水浴反復(fù)凍融3次。3 000 r/min離心5 min，收集含病毒上清液，此即重組腺病毒AdIL-10-OVA第一代毒種(P1)，棄沉淀。從P1代病毒上清(約3 ml)中取2 ml感染1個直徑10 cm培養(yǎng)皿的細胞(保證含細胞90%以上)。病毒擴增2 d，待大部分細胞脫離培養(yǎng)瓶底面即可收獲病毒，將細胞連同培養(yǎng)液一同收入15 ml離心管中，依據(jù)前面的凍融方法凍融3次，取上清進行下一代擴增，如此反復(fù)進行各代病毒擴增及收獲。腺病毒滴度測定采用TCID50法。

1.2.3 重組腺病毒介導(dǎo)目的基因表達測定 將293細胞接種至24孔板，分別按50、100、200病毒感染復(fù)數(shù)(mutiplicity of infection，MOI)加入病毒液，次日取上清，遵循ELISA試劑盒說明書的操作步驟進行IL-10檢測。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果

重疊PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1。菌液PCR結(jié)果顯示，所挑選陽性菌落含有目的插入片段(圖2)，測序結(jié)果顯示重組穿梭質(zhì)粒多克隆區(qū)域插入目的基因序列正確，測序峰圖(部分)見圖3，完整測序結(jié)果分析見圖1。

圖 1 瓊脂糖凝膠電泳分析重疊PCR產(chǎn)物Fig 1 Analysis of overlapping PCR products by agarose gel electrophoresis1：mIL-10+OVA PCR產(chǎn)物； 2：DNA Marker

圖 2 瓊脂糖凝膠電泳分析重組穿梭質(zhì)粒菌液PCR產(chǎn)物Fig 2 Analysis of PCR products of recombinant shuttle plasmid liquid by agarose gel electrophoresis1～8：IL-10+OVA單克隆鑒定PCR產(chǎn)物(包含載體上的一段序列，故比理論大); 9： DNA Marker

2.2 重組腺病毒擴增后AdIL-10-OVA滴度測定結(jié)果

重組腺病毒擴增后滴度測定TCID50 法測得擴增后AdIL-10-OVA滴度為 T0= 101+(10.5-0.5)=1011.0TCID50/ml，將TCID50/ml換算成PFU/ml，則為T=1011.0-0.7=1010.3=2×1010PFU/ml。

2.3 重組腺病毒介導(dǎo)融合目的基因表達

隨著MOI的增加，重組腺病毒感染293細胞上清中IL-10表達水平亦升高；融合表達載體的IL-10表達效率低于單獨表達IL-10載體，增大MOI可提高融合蛋白表達水平(圖4)。

3 討論

腺病毒是目前常用的基因治療的載體(Journal of Genetic Medicine website:www.wiley.com.uk/genmed/clinical)，具有以下優(yōu)勢：(1)基因轉(zhuǎn)移效率高，宿主細胞類型廣泛，既可以感染分裂期細胞，A：目的基因小鼠IL-10 ATG開始部分測序峰圖; B：目的基因融合部分序列; C：目的基因OVA ATG開始部分測序峰圖亦可以感染非分裂期細胞;(2)產(chǎn)生病毒滴度高，可達1011PFU/ml，易于制備和操作;(3)外源基因容量大，可插入7～8 kb的片段;(4)外源基因獨立于靶細胞染色體外表達，不會引起宿主細胞基因組的重組和突變。在用于遺傳性疾病或腫瘤基因治療時，腺病毒最大的劣勢在于其載體免疫原性和目標基因的表達時限，而當其用于免疫性疾病如變態(tài)反應(yīng)性疾病的治療時，卻不存在這樣的問題。因為短期甚至是單次的給藥足以引起有效的免疫效應(yīng)[19-25]，并且針對腺病毒的免疫反應(yīng)本身對糾正變態(tài)反應(yīng)性Th2相反應(yīng)有利，抗原激發(fā)前感染腺病毒能夠使針對抗原的Th2 相反應(yīng)轉(zhuǎn)向Th1相，從而抑制抗原特異性的變態(tài)反應(yīng)[26-27]，尤其值得注意的是，腺病毒可在呼吸道和腸道黏膜存活，具有黏膜活疫苗的應(yīng)用前景[28]。近期Park等[29]及Oomura等[30]分別用模式變應(yīng)原OVA和蟑螂變應(yīng)原建立哮喘模型，發(fā)現(xiàn)腺病毒介導(dǎo)的FOXP3基因可在呼吸道上皮細胞表達，非特異性的抑制不同變應(yīng)原所誘導(dǎo)的氣道炎癥?？诜歉鼮楹啽愣Ｓ玫慕o藥方式，并且口服腺病毒載體疫苗的效應(yīng)不受先前存在的針對疫苗載體的免疫反應(yīng)的影響。提示口服腺病毒載體方法可以重復(fù)使用，腺病毒載體是極有前景的免疫治療基因載體。

圖3重組穿梭質(zhì)粒pAdIL-10+6Gly+OVA目的基因測序結(jié)果

Fig3Sequencing results of recombinant shuttle plasmid PAdiL-10+6Gly+OVA

圖 4 不同感染復(fù)數(shù)重組腺病毒感染細胞上清IL-10水平Fig 4 IL-10 level in cell supernatant infected by different multiple of recombinant adenoviral

隨著DNA合成技術(shù)的快速發(fā)展，DNA合成長度及精度不斷提高，在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[31-32]。本研究擯棄傳統(tǒng)的克隆策略，通過DNA合成技術(shù)直接合成目的基因IL-10和OVA，顯著提高了效率，測序結(jié)果顯示，合成的基因IL-10和OVA序列與目標序列完全一致，然后通過重疊延伸PCR技術(shù)直接連接。重疊PCR是一種新型PCR技術(shù)，最早由Ho等[33]和Horton等[34]用于定向誘變和融合基因構(gòu)建，目前該技術(shù)在DNA重組構(gòu)建、基因定點改造、長片段基因合成、基因敲除、基因體外分子進化等方面得到了廣泛應(yīng)用。

細胞因子IL-10由活化的白細胞產(chǎn)生，具有以下強大的免疫調(diào)節(jié)功能：(1)可抑制炎性介質(zhì)及炎性趨化因子的分泌；(2)增強抗炎介質(zhì)如IL-1受體拮抗劑和可溶性腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)受體的釋放；(3)下調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ(major histocompatibility complex type Ⅱ，MHCⅡ)分子及共刺激分子如CD86(B7)的組成性及INF-γ誘導(dǎo)的表達，從而抑制單核巨噬細胞的抗原提呈功能；(4)抑制IL-12合成，影響Th1免疫；(5)促進B細胞增殖分化，阻止B細胞凋亡，阻止免疫球蛋白IgG4向IgE轉(zhuǎn)換；(6)降低IgE受體及其信號分子Syk、Fyn及Akt的表達，減輕IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)；(7)誘導(dǎo)T0細胞向Tr1細胞分化，并作為旁分泌因子作用于Treg細胞以維持FOXP3表達[35-36]。FOXP3是CD4+CD25+Treg細胞發(fā)育和功能的關(guān)鍵基因[37]，同時還是IL-2轉(zhuǎn)錄的負調(diào)節(jié)因子，其表達限制T細胞的活化和增生。IL-10在口服耐受建立早期發(fā)揮關(guān)鍵作用，Slavin等[38]研究發(fā)現(xiàn)，IL-10和髓鞘基質(zhì)蛋白同時口服可以明顯減低實驗性自身免疫性腦脊髓炎的嚴重程度和發(fā)生率，聯(lián)合口服IL-10和髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白亦可以顯著減少髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白誘導(dǎo)的實驗性自身免疫性腦脊髓炎的復(fù)發(fā)。

Sudowe 等[39]以腺病毒為載體構(gòu)建了表達變應(yīng)原的重組腺病毒疫苗，發(fā)現(xiàn)在致敏前給予單次劑量的重組腺病毒變應(yīng)原疫苗即可有效抑制變應(yīng)原特異IgE的產(chǎn)生，免疫反應(yīng)傾向Th1相。Yamasaki 等[40]研究也發(fā)現(xiàn)表達OVA的重組腺病毒疫苗單次十二指腸給藥能有效預(yù)防OVA口服引發(fā)的小鼠腹瀉及嚴重變態(tài)反應(yīng)。現(xiàn)有的研究在重組腺病毒變應(yīng)原疫苗對變態(tài)反應(yīng)的預(yù)防效應(yīng)方面取得了一致的結(jié)果，但其治療效應(yīng)有待進一步研究。Maecker等[41-42]構(gòu)建了多種細胞因子與模式變應(yīng)原OVA的融合表達質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)融合表達的細胞因子生物活性不受影響，可以改變針對OVA的變態(tài)反應(yīng)，融合表達載體的預(yù)防及治療效應(yīng)優(yōu)于二者的單獨聯(lián)合。本研究成功構(gòu)建了融合表達IL-10與變應(yīng)原的重組腺病毒口服疫苗，為后續(xù)變態(tài)反應(yīng)性疾病的預(yù)防和治療策略提供了有用的研究工具。

志謝:感謝北京協(xié)和醫(yī)院中心實驗室分子生物學(xué)平臺龍波博士、陳翠珠碩士在實驗過程中給予的無私幫助