邱若風, 黃忠平, 王麗麗

(浙江工業(yè)大學化學工程學院, 浙江 杭州 310014)

棉花是一種重要的纖維原料,與大豆、花生、油菜、向日葵共同被列為我國的五大油料作物。文獻[1]報道棉籽剝殼后的棉籽仁含油量約15%～40%。雖然棉籽中含有棉酚等有毒物質(zhì),但是隨著低酚棉研究的深入和脫酚技術(shù)的發(fā)展,精煉后的棉籽油可以放心食用。

棉籽油含有大量人體必需的脂肪酸,其中不飽和脂肪酸的含量接近70%,具有較高的營養(yǎng)價值,是一種有益于人體健康的優(yōu)質(zhì)食用油。同時棉籽油含有多種飽和脂肪酸,可以用作起酥油和人造奶油等[2]。目前,歐美國家限制使用含有反式脂肪酸的氫化植物油,而棉籽油不含反式脂肪酸,可以作為一種天然替代品[3]。同時,棉籽油中的脂肪酸經(jīng)過分離后可以作為工業(yè)原料生產(chǎn)肥皂、潤滑油和甘油等。近年來,隨著人們環(huán)保意識的提高,棉籽可以作為一種可再生的油料作物,棉籽油可以用來制備生物柴油[4,5]。

我國的棉花產(chǎn)量居世界前列。棉籽作為棉花的一部分,產(chǎn)量很大,如何有效地利用這一資源是我國棉花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點之一。無論是評價棉籽油的營養(yǎng)價值,還是考查棉籽油用作工業(yè)原料的可能性,我們都要研究棉籽油的脂肪酸組成。文獻報道可采用索氏提取法[6,7]、微波輔助提取法[8]等提取棉籽中的棉籽油。商連光等[6]采用近紅外光譜法直接分析提取后的棉籽油,但該方法不能具體測定各種脂肪酸的含量。有的文獻[7,8]先將提取到的棉籽油進行離線甲酯化,再用氣相色譜-質(zhì)譜法分析甲酯化后的棉籽油。但上述方法均需要大量有機試劑,前處理步驟耗時較長。

在線熱輔助甲基化-氣相色譜法是近年來迅速發(fā)展的一種適用于分析有機酸、多羥基醇、酯類、胺類等物質(zhì)的方法[9]。目前已有采用該方法并以四甲基氫氧化銨為甲基化試劑測定非正常食用油中脂肪酸組成的報道[10]。但是棉籽仁中含有較多的不飽和脂肪酸,堿性很強的甲基化試劑會使多不飽和脂肪酸的雙鍵發(fā)生異構(gòu)化和降解[11],因此在測定棉籽仁中的脂肪酸時需要選擇合適的甲基化試劑。

本文采用在線熱輔助甲基化-氣相色譜法對棉籽仁中的脂肪酸組成進行分析,對影響測定的主要因素如甲基化試劑、甲基化溫度等進行優(yōu)化,旨在建立分析棉籽仁中脂肪酸組成的方法。同時對市售食用油中的脂肪酸組成進行分析,比較棉籽仁和食用油的脂肪酸組成。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

GC-2010 Plus氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測器、GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本Shimadzu公司); PY-2020iD微型縱爐裂解器(日本Frontier Lab公司); BP211D分析天平(德國Sartorius公司); SQ-80B超聲振蕩器(中國無錫同建科技有限公司)。

甲醇(分析純,上海凌峰化學試劑有限公司);肉豆蔻酸甲酯(C14∶0)、棕櫚酸甲酯(C16∶0)、棕櫚油酸甲酯(C16∶1)、硬脂酸甲酯(C18∶0)、油酸甲酯(C18∶1)、亞油酸甲酯(C18∶1)、亞麻酸甲酯(C18∶3)、三甲基氫氧化硫(TMSH, 溶于0.2 mol/L甲醇溶液)、四甲基氫氧化銨(TMAH,分析純)購自上海阿拉丁公司。

5組棉籽產(chǎn)地分別為河南安陽(HNAY)、海南三亞(HNSY)、江蘇南京(JSNJ)、浙江金華(ZJJH)、浙江杭州(ZJHZ 1～5);食用油包括花生油、玉米油、葵花籽油。

1.2 溶液的配制

準確稱取四甲基氫氧化銨固體,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,超聲溶解,配制成質(zhì)量分數(shù)為2%的四甲基氫氧化銨甲醇溶液,于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

固體樣品:將棉籽去殼后碾碎成粉末,備用。液體樣品:稱取食用油樣品各5 mg,用甲醇定容至1 mL。

如圖1所示,取約0.3 mg固體樣品或1 μL液體樣品,置于樣品杯中,加入2 μL甲基化試劑,將樣品杯固定在進樣桿上,裝入裂解器,待儀器穩(wěn)定后,按下進樣按鈕,樣品杯迅速落到裂解器的加熱區(qū),樣品中的脂肪酸與甲基化試劑在高溫下瞬間反應(yīng)生成相應(yīng)的甲基化產(chǎn)物,同時啟動氣相色譜儀開始分析。

圖 1 在線熱輔助甲基化-氣相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)的示意圖Fig. 1 Schematic diagram of on-line pyrolytic methylation-GC/MS system

1.4 分析條件

色譜柱:DB-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, 5%苯基-95%聚二甲基硅氧烷);程序升溫條件:初始溫度50 ℃,以10 ℃/min升溫至200 ℃,保持10 min,再以10 ℃/min升溫至300 ℃,保持10 min;汽化室溫度：300 ℃;檢測器溫度:300 ℃;載氣:高純氮氣,分流比100∶1;柱流量:1 mL/min;裂解爐溫度：350 ℃;接口溫度：300 ℃。

離子源:電子轟擊源;離子源溫度:220 ℃;載氣:高純氦氣;傳輸線溫度:270 ℃;電離電壓:70 eV;掃描范圍:m/z50～600。

圖 2 添加(a)TMAH和(b)添加TMSH時棉籽仁的 甲基化-氣相色譜圖Fig. 2 On-line methylation-GC chromatograms of cottonseed with (a) TMAH and (b) TMSH C18∶2: methyl linoleate; TMAH: tetramethylammonium hydroxide; TMSH: trimethylsulfonium hydroxide.

2 結(jié)果與討論

2.1 在線熱輔助甲基化-氣相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1甲基化試劑的選擇

由于棉籽仁中含有多不飽和脂肪酸,例如亞油酸,為了消除衍生化反應(yīng)對多不飽和脂肪酸的異構(gòu)化作用,比較了TMAH和TMSH對脂肪酸的甲基化效果。圖2為棉籽仁在添加TMAH和TMSH條件下得到的在線甲基化-氣相色譜圖。經(jīng)過質(zhì)譜定性可以發(fā)現(xiàn),當使用TMAH作為甲基化試劑時可以觀察到亞油酸甲酯的異構(gòu)體,而使用TMSH時未觀察到亞油酸甲酯的異構(gòu)體。該結(jié)果表明使用TMSH能提高測定多不飽和組分的靈敏度,同時不會降低對飽和組分的測定結(jié)果。因此,選擇TMSH作為甲基化試劑。

2.1.2溫度對甲基化效率的影響

溫度對在線甲基化反應(yīng)的影響十分明顯,若溫度過低,甲基化反應(yīng)不完全;若溫度過高,三甲基氫氧化硫易發(fā)生分解,會造成樣品的損失,甲基化反應(yīng)不完全。在300、350和400 ℃溫度下對0.3 mg棉籽仁粉末進行在線熱輔助甲基化-氣相色譜分析,可以看出,不同溫度下硬脂酸甲酯、油酸甲酯和亞油酸甲酯的響應(yīng)情況(見圖3)。當溫度由300 ℃上升到350 ℃時,3種脂肪酸甲酯的峰面積增大;當溫度由350 ℃上升到400 ℃時,3種脂肪酸甲酯的峰面積基本不變。因此,選擇甲基化溫度為350 ℃。

圖 3 溫度對脂肪酸甲基化效率的影響Fig. 3 Effect of temperature on the methylation efficiency of fatty acids

2.1.3甲基化試劑用量的選擇

甲基化試劑的用量會影響脂肪酸的甲基化效率。甲基化試劑的用量過少,導致脂肪酸的甲基化反應(yīng)不完全;用量過多,不僅浪費試劑,還會降低脂肪酸的甲基化效率。實驗考察了當甲基化試劑用量為1、2和3 μL時0.3 mg棉籽仁中3種脂肪酸的甲基化效率(見圖4)。可以看出,隨著甲基化試劑用量的增加,飽和脂肪酸硬脂酸的甲基化效率有所增加,而不飽和脂肪酸油酸和亞油酸的甲基化效率下降。可能是因為在高溫、堿性較高的環(huán)境中目標物發(fā)生異構(gòu)化或者分解。因此,選擇甲基化試劑的用量為2 μL。

2.2 棉籽仁中脂肪酸組成的測定

棉籽仁中脂肪酸的定性采用標準品保留時間對照結(jié)合質(zhì)譜定性。8種脂肪酸甲酯的氣相色譜保留時間及質(zhì)譜特征離子見表1。圖5為不同產(chǎn)地的棉籽仁的在線甲基化-氣相色譜圖。從圖中可以看出,8種脂肪酸甲酯得到較好分離,分別為肉豆蔻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸、花生酸和二十二酸。采用峰面積歸一化法進行定量,計算棉籽仁中各種脂肪酸的含量,其脂肪酸組成見表2(花生酸與二十二酸含量較低,未進行定量計算)。

圖 4 TMSH用量對脂肪酸甲基化效率的影響Fig. 4 Effect of the volume of TMSH on the methylation efficiency of fatty acidsC18∶0: methyl stearate; C18∶1: methyl oleate.

No.Retention time/minFatty acid methyl esterCharacteristic ions (m/z)116.25methyl myristate (C14∶0)74, 199, 211, 242219.45methyl palmitoleate (C16∶1)55, 194, 236, 268319.91methyl palmitate (C16∶0)74, 227, 239, 270425.24methyl linoleate67, 220, 263, 294525.44methyl oleate55, 222, 264, 296626.24methyl stearate74, 255, 267, 298730.32methyl arachidate (C20∶0)74, 283, 295, 326832.88methyl docosanoate (C22∶0)74, 311, 323, 354

圖 5 棉籽仁的在線甲基化-氣相色譜圖Fig. 5 On-line methylation-GC chromatograms of cottonseed HNAY: Henan Anyang; JSNJ: Jiangsu Nanjing; HNSY: Hainan Sanya; ZJJH: Zhejiang Jinhua; ZJHZ: Zhejiang Hangzhou.

2.3 食用油中脂肪酸組成的測定

食用油中脂肪酸的定性采用標準品保留時間對照結(jié)合質(zhì)譜定性。圖6為3種食用油的在線甲基化-氣相色譜圖。從圖中可以看出,8種脂肪酸甲酯得到較好分離,分別為肉豆蔻酸、棕櫚油酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸、硬脂酸花生酸和二十二酸。采用峰面積歸一化法進行定量,計算食用油中各種脂肪酸的含量,其脂肪酸組成見表2(玉米油和葵花籽油中花生酸與二十二酸含量較低,未進行定量計算)。

圖 6 3種食用油的在線甲基化-氣相色譜圖Fig. 6 On-line methylation-GC chromatograms of three kinds of edible oils

2.4 棉籽仁與食用油中脂肪酸組成的比較

由表2可知,9個棉籽仁樣品中亞油酸的含量為43.20%～53.61%,棕櫚酸的含量為24.15%～27.30%,油酸的含量為16.51%～27.00%,硬脂酸的含量為2.32%～5.29%,肉豆蔻酸的含量為0.85%～1.11%,棕櫚油酸的含量為0.42%～0.85%。這與文獻[12]報道的基本一致。

棉籽仁中的不飽和脂肪酸有棕櫚油酸、油酸、亞油酸,占脂肪酸總含量的66.30%～72.54%，其中油酸的相對含量為16.51%～27.00%,亞油酸的相對含量為43.20%～53.61%。研究[13,14]表明,油酸和亞油酸通過參與人體的各種生理過程,起到降低血壓、血脂的作用,具有預(yù)防心腦血管疾病的功效。

棉籽仁中含有的飽和脂肪酸主要有肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸,占總脂肪酸相對含量的27.46%～33.70%，其中棕櫚酸的相對含量為24.15%～27.30%。研究[15]表明,棕櫚酸不易氧化,具有良好的起酥性和穩(wěn)定性,可用于食品制造業(yè)。文獻[4]報道,以棉籽油為原料制備的生物柴油具有十六烷值高、可再生等優(yōu)點。

為了分析不同產(chǎn)地棉籽仁中脂肪酸組成的差異,采用SPSS統(tǒng)計軟件對表2的結(jié)果進行相似性分析。由相似矩陣可知,5個產(chǎn)地的9個棉籽仁樣品之間的相似度均大于0.974,說明5個產(chǎn)地的9個棉籽仁樣品的脂肪酸相對含量差異不明顯,因此在棉籽油的開發(fā)和利用過程中無需考慮不同品種和地區(qū)之間差異性的影響。

表 2 不同產(chǎn)地棉籽仁與食用油中脂肪酸的相對含量

-: no data.

圖 7 9個棉籽仁樣品和8個食用油樣品的主成分分析Fig. 7 Principal component analysis of the nine cottonseed samples and eight edible oil samples

圖 8 9個棉籽仁樣品和8個食用油樣品的系統(tǒng)聚類分析Fig. 8 Hierarchical cluster analysis of the nine cottonseed samples and eight edible oil samples

為了比較棉籽仁與食用油中脂肪酸組成的差異,將表2的峰面積百分含量輸入SPSS統(tǒng)計軟件,調(diào)用因子分析模塊進行主成分分析。圖7為提取兩個主成分得到的9個棉籽仁樣品和8個食用油樣品的主成分分析圖。由圖7可見,棉籽仁聚成一組,與3種食用油明顯區(qū)分開來。

采用SPSS統(tǒng)計軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行了聚類分析。圖8為9個棉籽仁樣品和8個食用油樣品的系統(tǒng)聚類分析樹狀圖,更直觀地顯示了樣品逐步合并的過程。橫坐標為臨界值,即類間的距離,縱坐標為樣品名稱。臨界值越小,表示譜圖越相似。當臨界值小于10時,棉籽仁與玉米油、葵花籽油聚為一類，表明棉籽仁中的脂肪酸組成和玉米油、葵花籽油相似。在相似性分析中，棉籽仁中的脂肪酸組成與玉米油的相似度為0.960～0.992。

以上結(jié)果表明,棉籽油作為食用油具有較高的營養(yǎng)價值,如果將棉籽油中的脂肪酸進行分離可用作工業(yè)原料。

3 結(jié)論

建立了測定棉籽仁中脂肪酸組成的在線熱輔助甲基化-氣相色譜法。利用建立的方法對5個產(chǎn)地的棉籽仁和3種食用油的脂肪酸組成進行分析,結(jié)果表明，不同產(chǎn)地棉籽仁的脂肪酸組成差異不明顯,且棉籽仁的脂肪酸組成與玉米油最為接近。棉籽油作為食用油具有較高的營養(yǎng)價值,如果將棉籽油中的脂肪酸進行分離可用作工業(yè)原料。該方法簡單、快速、準確,適合分析棉籽仁和食用油中的脂肪酸組成。