劉建勛，孫明謙，任鈞國，林 力

（中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京中藥藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091）

1 前言

中藥復(fù)方是中醫(yī)治病的主要形式，是按一定的組方原則，選擇適宜的藥味及劑量配伍而成。中藥復(fù)方功效是在傳統(tǒng)中醫(yī)理論的基礎(chǔ)上對中藥臨床作用的系統(tǒng)總結(jié)，代表了復(fù)方的整體效應(yīng)，該效應(yīng)是多種特定化學(xué)成分在特定病理?xiàng)l件下對機(jī)體發(fā)生作用，進(jìn)行調(diào)整和整合后的生物效應(yīng)表達(dá)，而這些化學(xué)成分就是中藥復(fù)方功效的物質(zhì)基礎(chǔ)?，F(xiàn)代研究表明中藥復(fù)方功效具有多靶點(diǎn)、多效應(yīng)、多機(jī)制的作用特點(diǎn)。這主要是由于中藥復(fù)方的化學(xué)成分種類和數(shù)量的多樣性，形成了一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)成分體系。隨著中藥化學(xué)成分分離、鑒定等新技術(shù)的發(fā)展，中藥復(fù)方化學(xué)成分在體內(nèi)、體外的研究取得了極大的進(jìn)展，青蒿素獲得諾貝爾醫(yī)學(xué)或生理學(xué)獎(jiǎng)則是中藥化學(xué)成分研究的最好代表。但是，千百年來，在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，中藥復(fù)方廣泛用于中醫(yī)臨床，療效確切。因此，以中藥復(fù)方為研究對象，如何研究并確證中藥復(fù)方功效的物質(zhì)基礎(chǔ)是目前中藥復(fù)方研究亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。

2 中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的思路

目前，中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究較少，多是進(jìn)行中藥復(fù)方藥效成分或有效成分的研究，主要是在中藥化學(xué)成分分離的基礎(chǔ)上或采用活性追蹤的方法，采用單一的藥效評價(jià)指標(biāo)進(jìn)行篩選、確證。由于中藥復(fù)方復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)必然導(dǎo)致藥物效應(yīng)的復(fù)雜性，因此單純的藥效評價(jià)方法難以體現(xiàn)中醫(yī)臨床辨證論治、病證結(jié)合、方證相應(yīng)的用藥特點(diǎn)[1,2]。因此中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究既要保持傳統(tǒng)中藥的特色，又要結(jié)合現(xiàn)代的科學(xué)技術(shù)手段，對中藥的活性成分和作用機(jī)制進(jìn)行闡明，從而研發(fā)出適合臨床治療且機(jī)理明確的藥物。為此，我們在已建立的中藥復(fù)方功效現(xiàn)代研究與評價(jià)體系的基礎(chǔ)上（獲得2014年國家科學(xué)技術(shù)進(jìn)步獎(jiǎng)二等獎(jiǎng)），提出了中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的新思路。即將中醫(yī)臨床證候的診斷標(biāo)準(zhǔn)、療效評價(jià)技術(shù)與方法應(yīng)用于中藥復(fù)方功效的研究，在明確中藥復(fù)方功效現(xiàn)代藥理學(xué)內(nèi)涵后，以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合中藥藥理、中藥化學(xué)、中藥代謝、生物系信息學(xué)等多種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展中藥復(fù)方功效與化學(xué)成分之間的相關(guān)性研究，通過中藥復(fù)方功效評價(jià)，中藥復(fù)方指征物質(zhì)基礎(chǔ)研究，構(gòu)建中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究與評價(jià)體系，闡釋中藥復(fù)方功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)理[3-4]（見圖1）。

圖1 中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法

3 建立中藥復(fù)方功效的評價(jià)技術(shù)指標(biāo)體系

中藥復(fù)方功效評價(jià)的主要難點(diǎn)是如何在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下對中藥復(fù)方的功能主治進(jìn)行評價(jià)，并與中藥藥效的評價(jià)實(shí)現(xiàn)有機(jī)的整合。因此我們提出源于中醫(yī)臨床的中藥復(fù)方功效學(xué)研究思路與方法，簡單講就是采用擬臨床的研究思路制備符合中醫(yī)臨床病證特征的動(dòng)物模型，建立動(dòng)物模型的中醫(yī)證候評價(jià)技術(shù)與方法；開展中藥復(fù)方整體、細(xì)胞、分子等多層次的藥效學(xué)評價(jià)；建立反映中藥復(fù)方功效的中藥藥效評價(jià)技術(shù)指標(biāo)體系。進(jìn)而開展中藥復(fù)方功效指征物質(zhì)基礎(chǔ)研究。本文以氣虛血瘀證為例，闡釋益氣活血功效的藥效評價(jià)技術(shù)指標(biāo)體系的建立（見圖2）[7]。

3.1 建立氣虛血瘀證病證結(jié)合動(dòng)物模型及其評價(jià)技術(shù)指標(biāo)體系

根據(jù)冠心病氣虛血瘀證的中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，我們從觀察目的、研究過程和方法手段三個(gè)方面進(jìn)行了重新的頂層設(shè)計(jì)，對冠心病、腦梗塞氣虛血瘀證進(jìn)行了前瞻性臨床研究，獲得了病證相關(guān)的診斷指標(biāo)，結(jié)合現(xiàn)代研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞作為一個(gè)功能復(fù)雜、代謝活躍的血管內(nèi)分泌器官，其結(jié)構(gòu)的損傷及由此引發(fā)的內(nèi)分泌功能紊亂是導(dǎo)致氣虛血瘀證病理生理異常的根本原因，表現(xiàn)在表達(dá)和分泌血管活性物質(zhì)、凝血、抗凝及纖溶等物質(zhì)異常。依此，我們采用球囊拉傷冠脈血管內(nèi)皮，引發(fā)白細(xì)胞粘附、血小板聚集、動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成、組織缺血，制備了與臨床接近的慢性小型豬冠心病氣虛血瘀證模型[8]。另外，我們考慮到臨床氣虛血瘀證形成的因素，通過體勞、神勞以及復(fù)合因素的刺激，建立了冠心病及腦梗死氣虛血瘀證大鼠模型[9]。將中醫(yī)臨床辯證即主癥、兼癥、舌象、脈象在內(nèi)的四診信息用于動(dòng)物模型證候的研究，并進(jìn)行客觀化分級(jí)評分，如大鼠心功能、代表主癥；空場實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)、力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)間代表兼癥；舌面色彩飽和度代表舌象；脈搏搏動(dòng)幅度代表脈象。建立了氣虛血瘀證動(dòng)物證候評價(jià)的新方法，同時(shí)采用系統(tǒng)生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)和方法，對氣虛血瘀證模型動(dòng)物的分子變化進(jìn)行評價(jià)，建立氣虛血瘀證的系統(tǒng)評價(jià)技術(shù)指標(biāo)體系，為中藥復(fù)方功效的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供合適的評價(jià)模型。對腦鈉肽、內(nèi)皮素、血液黏度、凝血功能等指標(biāo)進(jìn)行檢測。與臨床病因?qū)W以及與中醫(yī)相關(guān)理論體系的聯(lián)系更密切，在完整體現(xiàn)中醫(yī)證候的特征方面具有一定的優(yōu)勢，更符合臨床。

3.2 建立擬臨床的氣虛血瘀相關(guān)細(xì)胞模型及其評價(jià)技術(shù)指標(biāo)體系

根據(jù)氣虛血瘀證動(dòng)物模型的研究結(jié)果，結(jié)合氣虛血瘀證的病理生理學(xué)基礎(chǔ)研究，模擬整體，在細(xì)胞水平上我們提出證候細(xì)胞模型的概念，即與臨床或整體證候模型病理生理學(xué)相近的細(xì)胞模型。如氣虛為心腦血管疾病的臨床常見證型之一，心肌細(xì)胞是心功能的主要結(jié)構(gòu)單位；神經(jīng)元是腦功能的主要結(jié)構(gòu)單位，心肌細(xì)胞和神經(jīng)元的缺血缺氧性損傷是氣虛的病理基礎(chǔ)之一，心肌細(xì)胞缺血造成心功能的損害及神經(jīng)元的缺血造成的腦組織功能障礙主要是由于氧糖剝奪導(dǎo)致的細(xì)胞能量代謝障礙，而缺血再灌注更加重了細(xì)胞能量代謝障礙。因此，我們采用培養(yǎng)心肌細(xì)胞及神經(jīng)元氧糖剝奪/復(fù)氧的方法建立氣虛細(xì)胞模型，研究發(fā)現(xiàn)：心肌細(xì)胞或神經(jīng)元氧糖剝奪損傷后，上清液中乳酸脫氫酶（LDH）含量大量增加，ATP含量下降，提示了心肌細(xì)胞或神經(jīng)元壞死，以及細(xì)胞能量代謝障礙，胞內(nèi)ATP合成不足，是產(chǎn)生氣虛證的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)，ATP減少使得代謝終產(chǎn)物在胞漿中積聚，能量代謝的關(guān)鍵酶的活性降低，葡萄糖、脂肪酸等攝取受到抑制，大部分代謝終產(chǎn)物沉積，形成“血瘀”的物質(zhì)基礎(chǔ)。證候細(xì)胞模型及評價(jià)指標(biāo)體系的建立為在細(xì)胞水平進(jìn)行中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的研究與確證提供了適合的細(xì)胞模型。

4 建立中藥復(fù)方功效指征物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法

中藥復(fù)方是依靠其物質(zhì)基礎(chǔ)發(fā)揮作用的，同時(shí)由于中藥復(fù)方化學(xué)成分眾多，所以其功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究也是難點(diǎn)問題。但要實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方新藥研發(fā)的現(xiàn)代化，物質(zhì)基礎(chǔ)又是必然要求，這也是中藥實(shí)現(xiàn)高水平的質(zhì)量控制和明確的作用機(jī)理的基礎(chǔ)。中藥復(fù)方可能含有成百上千種成分，且大部分含量不高，結(jié)構(gòu)不明，把它們都研究清楚是不可能的。為此我們提出“中藥指征成分”的概念，化繁為簡，將中藥中其關(guān)鍵作用的代表性成分，作為中藥的指征成分，通過這些關(guān)鍵成分研究，實(shí)現(xiàn)對中藥物質(zhì)基礎(chǔ)的表征，進(jìn)而對中藥的功效進(jìn)行闡釋[10]。在前期建立的中藥復(fù)方功效評價(jià)體系的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對中藥復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)研究與病證動(dòng)物模型相結(jié)合，與特定功效相結(jié)合，進(jìn)而挖掘在體內(nèi)發(fā)揮作用的化學(xué)成分。以動(dòng)態(tài)的觀點(diǎn)結(jié)合中藥復(fù)方具體的應(yīng)用環(huán)境來認(rèn)識(shí)其功效成分。凡是能治療中醫(yī)的“證”或西醫(yī)的“病”的化學(xué)成分就是中藥復(fù)方作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。這種物質(zhì)基礎(chǔ)分別由代表不同藥理指標(biāo)的化學(xué)成分所指征，整合、分析藥理作用與指征成分的對應(yīng)關(guān)系，深入探討與生物效應(yīng)密切相關(guān)的指征成分體內(nèi)過程和作用機(jī)理，即有可能闡釋中藥復(fù)方的功效及其物質(zhì)基礎(chǔ)。這種思路的特點(diǎn)與優(yōu)勢是省略了中藥復(fù)方有效成分非常困難的體內(nèi)外篩選，而直接對與生物效應(yīng)有關(guān)的指征成分進(jìn)行解析。具體通過結(jié)合臨床特點(diǎn)，建立相應(yīng)動(dòng)物模型，通過PK-PD相關(guān)性研究方法，確定中藥復(fù)方指征藥效成分，在此基礎(chǔ)上通過對指征藥效成分的體內(nèi)過程、配伍關(guān)系及交互影響、藥理作用及作用通路和靶點(diǎn)的研究，以闡釋中藥復(fù)方發(fā)揮功效的物質(zhì)基礎(chǔ)及其作用機(jī)理[11,12]。

以雙參通冠方為例，首先通過定性定量分析獲得雙參通冠方的20種吸收入血藥物成分譜。然后測定了雙參通冠與心肌缺血模型動(dòng)物后的血壓、心率、左室內(nèi)壓、心肌收縮力、外周阻力、冠脈血流量、心肌耗氧量、心肌缺血程度及范圍等24個(gè)藥效指標(biāo)在13個(gè)觀測時(shí)間點(diǎn)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，根據(jù)中醫(yī)基礎(chǔ)理論和中藥復(fù)方特點(diǎn)，建立了基于穩(wěn)健變換、基線漂移處理、有效性判斷和差值分析等分析方法和數(shù)學(xué)模型，較好的解決了中藥多成分、多藥效指標(biāo)相關(guān)性分析的關(guān)鍵科學(xué)問題。結(jié)果確定了雙參通冠方中人參皂苷Re、Rb1、Rd、Rc、Rb2/3、Rf、脫氫紫堇堿、四氫巴馬汀、小檗堿，丹酚酸B、紫草酸和迷迭香酸12個(gè)指征藥效成分[10]。

5 中藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)闡釋及作用機(jī)理研究

通過建立中藥復(fù)方功效的評價(jià)體系和指征物質(zhì)基礎(chǔ)的研究方法，為中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究提供了有效的技術(shù)保證和明確的研究對象。聚焦到復(fù)方中關(guān)鍵的活性指征成分，對其功效進(jìn)行評價(jià)，可以對中藥復(fù)方的作用機(jī)理進(jìn)行明確的闡釋，從而實(shí)現(xiàn)中藥復(fù)方新藥研發(fā)中的質(zhì)量可控，療效確切，機(jī)理明確。由于這一評價(jià)體系源于臨床，以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可以反證該理論的科學(xué)性以及該動(dòng)物模型的可靠性。以益氣活血方藥雙參通冠膠囊（人參、丹參、延胡索三種提取物配伍）為例，闡釋其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理的研究方法（見圖2）。

研究證實(shí)該雙參通冠方具有抗心肌缺血、增加冠脈血流量、降低冠脈阻力、降低心肌耗氧量，增加心功能、抗血栓形成、改善血液流變性、抗心律失常、抗氧化等作用。首先根據(jù)這些藥效，對雙參通冠方中的指征活性成分對相關(guān)藥效指標(biāo)的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行研究[13]。該復(fù)方的指征藥效成分主要有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、丹酚酸A、迭迷香酸、延胡索乙素、脫氫紫堇堿、鹽酸小檗堿及鹽酸巴馬汀等，系統(tǒng)歸納不同指征成分的藥效特點(diǎn)，作為中藥功效物質(zhì)基礎(chǔ)重要組成部分[14,15]。同時(shí)結(jié)合中醫(yī)理論，根據(jù)“氣虛于脈而血瘀，血阻于脈則氣虛”的觀點(diǎn)，進(jìn)行在體實(shí)驗(yàn)的觀察，給與雙參寧心膠囊治療8周后，氣虛血瘀證冠心病小型豬的冠脈管腔狹窄得到改善，可重新見到造影劑的充盈，管腔直徑有所增加，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)分泌功能也得到恢復(fù)，表現(xiàn)在內(nèi)皮素含量下降，NO含量增加。益氣活血藥的血管調(diào)節(jié)作用反過來帶來“氣虛血瘀”癥狀的改善，由管腔狹窄造成心肌細(xì)胞喪失減少，抑制了心肌細(xì)胞自噬的發(fā)生，血流動(dòng)力學(xué)的恢復(fù)，增加左心做功能力，改善心肌細(xì)胞代謝，使氣虛證得到緩解；雙參寧心膠囊還可降低慢性睡眠剝奪建立的氣虛血瘀證大鼠的全血粘度以及血漿粘度，這體現(xiàn)了“血瘀”證的緩解。在整體動(dòng)物模型動(dòng)物研究的基礎(chǔ)上再應(yīng)用氣虛血瘀相關(guān)細(xì)胞模型對雙參通冠方中的指征成分進(jìn)行研究。以活血藥丹參的有效成分丹酚酸B為代表，從自噬調(diào)節(jié)及促進(jìn)血管新生兩個(gè)角度，反證了根據(jù)“氣虛于脈而血瘀”施以益氣活血治療的有效性。根據(jù)“饑則損氣”的理論，我們繼續(xù)進(jìn)行了離體實(shí)驗(yàn)的觀察，用細(xì)胞饑餓法造成心肌細(xì)胞“氣虛”狀態(tài)，給予丹酚酸B治療后，大量聚集在細(xì)胞漿內(nèi)的LC3-II熒光強(qiáng)度顯著下降，提示了自噬在一定程度上被丹酚酸B所抑制，伴隨自噬抑制同時(shí)發(fā)生改變還有細(xì)胞活性及能量ATP的恢復(fù)，提示益氣活血成分丹酚酸B可限制氣虛的發(fā)生；同時(shí)，從“脈”入手，發(fā)現(xiàn)丹酚酸還可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)其遷移及粘附

能力，活血成分阿魏酸可促進(jìn)體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖；利用雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了丹酚酸可增加體外新生血管的密度，促進(jìn)了缺血區(qū)域的血管新生，改善缺血區(qū)的血供情況，逆轉(zhuǎn)“氣虛”程度的發(fā)展。圖3為雙參通冠膠囊的藥理作用與機(jī)制。

圖2 氣血血瘀證的研究與評價(jià)方法

圖3 雙參通冠方的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)理

此外，應(yīng)用中藥復(fù)方指征成分的有效性研究方法，還可以對中藥復(fù)方的配伍機(jī)制進(jìn)行研究。通過正交設(shè)計(jì)確定復(fù)方中藥物的最佳劑量配伍，然后比較配伍組方與各組成成分對藥效指標(biāo)的影響，分析比較其藥理作用和各成分變化之間的相關(guān)性，從而明確中藥復(fù)方發(fā)揮功效的有效成分配伍機(jī)制。如應(yīng)用乳鼠心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型選擇經(jīng)過數(shù)據(jù)處理得到有效成分的最佳組方為迷迭香酸、脫氫紫堇堿、丹酚酸A和延胡索乙素，同時(shí)發(fā)現(xiàn)有效成分之間具有一定的交互影響；在整體的配伍機(jī)制研究中通過七種不同配伍方式下大鼠血漿中主要有效成分的藥代參數(shù)的分析，闡釋了雙參通冠方配伍的藥代機(jī)制[5]。

6 總結(jié)與展望

構(gòu)建中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究與評價(jià)體系，一直是多年來中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的重點(diǎn)。中藥復(fù)方功效的現(xiàn)代科學(xué)研究是一個(gè)的系統(tǒng)工程，需要多學(xué)科的相互融合，中西醫(yī)的相互融合，傳統(tǒng)中醫(yī)理論與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的相互融合。其研究既需要體現(xiàn)中醫(yī)臨床與理論的特點(diǎn)，又要對療效、機(jī)制進(jìn)行明確的科學(xué)驗(yàn)證與闡釋。中藥復(fù)方功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究體系的構(gòu)建不僅有利對闡明傳統(tǒng)中醫(yī)理論科學(xué)內(nèi)涵，同時(shí)也為中藥新藥的研發(fā)提供了更為先進(jìn)的平臺(tái)，有利實(shí)現(xiàn)中藥療效評價(jià)的明確、活性成分的明確、作用機(jī)制的明確。雖然中藥系統(tǒng)復(fù)雜，但其功效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究日益受到關(guān)注，越來越多先進(jìn)的技術(shù)手段如系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等應(yīng)用于該領(lǐng)域的研究中，也會(huì)隨之產(chǎn)生更多新思路、新理論、新方法，從而促進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的發(fā)展。